徐晓东，宋 泽，冯 涛，宋诗清*，孙 敏，姚凌云

（上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418）

草菇又名兰花菇、苞脚菇，是一种重要的热带亚热带菇类。目前，全球栽培最多的6 种食用菌里就有草菇[1]。我国草菇产量占全世界总产量的70%～80%，居世界之首[2]。2013年我国草菇产量为31.1万 t，2014年产量为33.5万 t，占同期国内食用菌总产量的1.1%。草菇营养丰富，味道鲜美，富含蛋白质和多种氨基酸，其中必需氨基酸含量占40.47%～44.47%[3]。组成食用菌蛋白的氨基酸中含有高比例的谷氨酰胺和谷氨酸，一级结构中富含鲜味肽序列，是生产高品质呈味基料的优质原料[4]。

食用菌的滋味是由丰富多样的风味物质引起的，主要分为挥发性和非挥发性两类。非挥发性风味物质主要是一些可溶性糖及糖醇、有机酸、游离氨基酸以及5’-核苷酸等[5-6]。近年来，国内外研究者对草菇等食用菌的研究主要集中在多糖、贮藏保鲜及初级调味品开发等研究方面，例如研究不同方法提取草菇多糖体外抗氧化活性[7]、草菇多糖的分离纯化和生物活性[8]、草菇贮藏过程中抗氧化酶活力的变化[9]、分析食用菌中的呈味物质及鲜味评价[10-11]，但研究不同提取方法对草菇呈味物质释放的影响鲜见报道。本实验以可溶性糖及糖醇、有机酸、5’-核苷酸、游离氨基酸组成和含量、分子质量分布为指标，研究常压蒸煮、高压蒸煮以及酶解处理3 种预处理方法对草菇呈味物质释放的影响，为食用菌调味料的开发及风味增强肽产品的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草菇成熟子实体采自上海市农业科学院庄行综合试验基地。

纤维素酶（20 000 U/g）、风味蛋白酶（20 000 U/g）、食用菌水解酶（2 000 U/g） 广西南宁庞博生物工程有限公司；海藻糖、岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、甘露醇、5’-核苷酸标准品美国Sigma公司；氨基酸标准品 日本Wako公司；其他试剂 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ICS2500型离子色谱仪、Carbo Pac PA-20阴离子交换分析柱、Carbo Pac MA-1阴离子交换柱 美国Dionex公司；600高效液相色谱仪 美国Waters公司；Ultimate AQ-C18色谱柱 上海月旭材料科技有限公司；Green ODS-AQ C18色谱柱 上海易创仪器分析有限公司；ATN-300全自动凯氏定氮仪 上海洪纪仪器设备有限公司；754PC紫外-可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；GL-21M高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；DHG-9145A型鼓风干燥箱 HWS28型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；BF00A粉碎机 上海淀久机械制造有限公司；Milli-Q超纯水设备 美国Ultra公司。

1.3 方法

1.3.1 原料前处理

所采集的草菇用流动自来水冲洗后，一部分用于测定水分含量，另一部分用粉碎机打磨成匀浆，-18 ℃冷冻备用。

1.3.2 草菇样品的不同处理

1.3.2.1 草菇酶解液的制备

称取100 g匀浆样品，按料液比1∶40（g/mL）加入去离子水，在pH 3.5、温度45 ℃条件下，加入纤维素酶0.5 g，酶解1.5 h；然后调节pH值为6.0，温度为50 ℃，加入风味蛋白酶0.4 g，继续酶解1.5 h，升温至90 ℃灭酶5 min后，7 000 r/min冷冻离心15 min，取上清液备用。

1.3.2.2 草菇常压蒸煮液的制备

称取100 g匀浆样品，按料液比1∶1.5（g/mL）加入去离子水，100 ℃蒸煮2 h，蒸煮液冷却后，7 000 r/min冷冻离心15 min，取上清液备用。

1.3.2.3 草菇高压蒸煮液的制备

称取100 g匀浆样品，按料液比1∶1.5（g/mL）加入去离子水，在40 kPa压力下蒸煮1.5 h，蒸煮液冷却后，7 000 r/min冷冻离心15 min，取上清液备用。

1.3.3 指标的测定

1.3.3.1 新鲜草菇中的水分、总糖、粗蛋白、粗脂肪含量测定

对洗净的鲜菇的水分、总糖、粗蛋白和粗脂肪含量进行检测。水分含量的检测采用烘箱法，参照文献[12]。总糖的检测采用苯酚-硫酸法，参照文献[13]。粗蛋白的检测采用凯氏定氮法，参照文献[14]。粗脂肪含量测定采用酸水解法，参照文献[15]。

1.3.3.2 可溶性糖测定

可溶性糖的提取参考Ajlouni等[16]的方法。分别称取1 g制备样，加入50 mL 80%乙醇溶液，摇匀后于30 ℃摇床振摇45 min，抽滤。将滤渣用80%乙醇溶液冲洗3 次，取滤液于55 ℃真空旋转蒸发去除乙醇，超纯水定容至10 mL。将样品12 000 r/min离心10 min后进行稀释，上清液过0.22 μm混合纤维素酯（mixed cellulose ester，MCE）微孔滤膜上机测试。

可溶性糖含量的测定：单糖：Carbo Pac PA-20阴离子交换分析柱（150 mm×3 mm）；柱温30 ℃；流动相为纯水和0.25 mol/L NaOH溶液，流速为0.45 mL/min，进样量25 μL；可溶性糖醇：Carbo Pac MA-1阴离子交换柱（4 mm×250 mm）；柱温30 ℃；流动相为0.48 mol/L NaOH溶液，流速为0.4 mL/min，进样量25 μL。

1.3.3.3 有机酸测定

分别称取1 g制备样，加入50 mL 0.1 mol/L盐酸溶液，60 ℃振摇60 min提取有机酸。待冷却后将提取液12 000 r/min离心15 min，上清液过0.22 μm MCE微孔滤膜用高效液相色谱仪检测。色谱条件：Green ODS-AQ C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为10 mmol/L KH2PO4缓冲盐溶液，pH 2.8，流速1.0 mL/min；紫外检测波长210 nm；柱温30 ℃；进样量5 μL。通过标准品的出峰时间及峰面积建立的标准曲线计算样品中相应物质的含量。

1.3.3.4 游离氨基酸测定

采用OPA FMOC柱前衍生化法测定[17]。色谱条件：ODS HYPERSIL色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温40 ℃；流速1 mL/min。流动相：A相：8.0 g乙酸钠溶于1 000 mL水中，再加入225 μL三乙胺，搅拌并滴加5%的醋酸溶液，将pH值调至7.2，加入5 mL四氢呋喃，混合后备用。B相：8.0 g乙酸钠溶于400 mL水中，滴加2%醋酸溶液将pH值调至7.2，将此溶液加入800 mL乙腈和800 mL甲醇，混合后备用。洗脱程序：0～17.0 min，B相0%～60%；17.0～18.0 min，B相60%～100%；18～23 min，B相100%。

1.3.3.5 5’-核苷酸测定

5’-核苷酸的提取参考Taylor等[18]方法。分别称取1 g制备样，加入25 mL蒸馏水，煮沸1 min，冷却至室温后于12 000 r/min离心15 min，取出上清液，废渣以相同方法重提一次，合并上清液，定容至50 mL。取定容后的上清液过0.22 μm MCE微孔滤膜，由高效液相色谱仪进行5’-核苷酸含量的检测。色谱条件：Ultimate AQ-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相10 mmol/L KH2PO4缓冲液（pH 4.68），检测波长259 nm，柱温30 ℃，进样量5 μL。通过标准品的出峰时间及峰面积建立的标准曲线计算样品中相应物质的含量。

1.3.3.6 分子质量的分布测定

采用高效液相色谱法。色谱条件：TSKgel 2000 SWXL色谱柱（300 mm×7.8 mm）；流动相：乙腈-水-三氟乙酸体积比45∶55∶0.1；柱温30 ℃；流速0.5 mL/min。

1.4 数据分析

所有实验每个样品做3 次平行，数值以 ±s表示，由SPSS统计分析软件进行显著性分析，分析方法为最小显著极差法（least significant rang，LSR），显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 不同处理方法对草菇可溶性糖及糖醇含量的影响

新鲜草菇的水分质量分数高达82.4%，总糖、粗脂肪、粗蛋白质量分数分别为35.1%、1.24%、24.3%。食用菌中小分子可溶性糖及糖醇是其甜味的主要来源[19]，但并不是食用菌特有的风味。由表1可知，草菇中含量最高的是海藻糖，占可溶性糖总量的50%以上。海藻糖是食用菌中的一种特有的糖，是一种低致龋性甜味剂[20]，因为其温和的甜度、稳定的性能及良好的保湿效果，海藻糖近些年来常被用于食品或饮料中[21]。甘露醇是唯一能检测到的糖醇，是草菇的主要糖醇类物质，其能量是糖的一半，由于其不容易被人体吸收，因此不会像糖一样增加太多胰岛素水平，也不易引起蛀牙[22]。

表1 草菇原液及不同制备液的可溶性糖及糖醇含量Table1 Contents of soluble sugar and sugar alcohol of mushroom homogenate before and after different treatments

和原液相比，常压蒸煮制备液可溶性糖的总量显著降低，主要原因可能是还原糖参与美拉德反应导致的；高压蒸煮制备液可溶性糖的总量和草菇原液基本相同，虽然高压蒸煮过程中也伴随有美拉德反应，但高压使得细胞破坏程度更大，释放了某些糖类，推测糖的释放量和参与反应的量相当，导致可溶性糖的总量基本不变，其中海藻糖、阿拉伯糖和甘露糖的含量明显增加，岩藻糖、鼠李糖及葡萄糖含量显著降低。和原液相比，由纤维素酶和风味蛋白酶分步酶解作用极显著地提高了可溶性糖的总量，主要表现为葡萄糖含量的明显增加，原因可能是由于纤维素酶（β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶）是降解纤维素生成葡萄糖的一种酶，所以导致酶解物中葡萄糖含量显著增加。

2.2 不同处理方法对草菇中有机酸含量的影响

表2 草菇原液及不同制备液的有机酸含量Table2 Content of organic acids of mushroom homogenate before and after different treatments

如表2所示，和原液相比，常压蒸煮制备液有机酸总量显著增加，特别是乙酸和丁二酸。乙酸具有特殊味道，能对人的舌后部产生较强的刺激[23]，丁二酸钠盐是鲜味的主要呈味成分。酒石酸和富马酸的含量稍有增加，酒石酸存在于多种植物中，特别是葡萄中含量很多[24]，常用于制造饮料；富马酸具有类似水果味，可作为酸味剂，用于清凉饮料、水果糖、果冻、冰淇淋等，大多与柠檬酸并用。苹果酸的含量稍有降低，柠檬酸的含量显著降低，柠檬酸具有清新的、新鲜的酸味，但这种味道和苹果酸不同。

和原液相比，高压蒸煮制备液有机酸总量增加显著，其中乙酸和丁二酸含量也显著增加，酒石酸、苹果酸和富马酸的含量稍有增加，柠檬酸的含量显著降低；同时高压蒸煮也检测到乳酸的存在。相反，复合酶解制备液有机酸总量显著降低，其原因是苹果酸和柠檬酸的含量显著降低所致。无论蒸煮还是酶解，都对草菇组织中有机酸的释放有促进作用，对于含量降低的有机酸其原因可能是参与了化学反应所致。

2.3 不同处理方法对草菇中的游离氨基酸及5’-核苷酸的影响

表3 草菇原液及不同制备液的游离氨基酸及5’-核苷酸含量Table3 Contents of free amino acids and 5’-nucleotides of mushroom homogenate before and after different treatments

游离氨基酸是食用菌中重要的鲜味活性物质。由表3可知，常压蒸煮、高压蒸煮和复合酶解作用后的游离氨基酸总量均有所增加。3 种处理方法相比，蒸煮获得的游离氨基酸更多，尤其是高压蒸煮，其主要原因是高温高压对植物细胞壁的降解作用更剧烈，使更多的游离氨基酸释放出来。其中天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸的含量在经过不同处理之后都有所增加，以高压蒸煮制备液增加的最显著。天冬氨酸和谷氨酸是草菇中主要的呈鲜物质，亮氨酸和脯氨酸是参与美拉德反应、产生呈味物质的重要前体物[25]。

根据氨基酸的呈味特性，将其分为鲜味、甜味、苦味以及无味4 种，鲜味氨基酸：天冬氨酸+谷氨酸；甜味氨基酸：苏氨酸+丝氨酸+甘氨酸+丙氨酸+脯氨酸；苦味氨基酸：缬氨酸+甲硫氨酸+异亮氨酸+亮氨酸+苯丙氨酸+组氨酸+精氨酸；无味氨基酸：半胱氨酸+酪氨酸+赖氨酸，分别计算其含量，结果如表4所示。

表4 游离氨基酸分类及含量Table4 Types and contents of free amino acids in mushroom homogenate before and after different treatments

谷氨酸与食盐结合形成L-谷氨酸钠是鲜味的代表物质，也是味精的主要成分，虽然天冬氨酸钠盐的鲜味程度低于L-谷氨酸钠的10%[26]，但是仍具有明显的鲜味，通常把天冬氨酸和谷氨酸均归类为鲜味氨基酸，由表4可知，二者总量约占游离氨基酸总量的20%。丙氨酸是重要的甜味氨基酸，与谷氨酸等鲜味物质相互作用具有提鲜效果[27]，常压蒸煮、高压蒸煮和复合酶分步作用后的丙氨酸含量都有所增加，其中以高压蒸煮最为明显。高压蒸煮制备液的鲜味氨基酸、甜味氨基酸以及苦味氨基酸的含量都增加的最显著。

草菇中只检测出5’-鸟苷酸，是对鲜味有贡献的呈味核苷酸，5’-鸟苷酸与L-谷氨酸钠有强烈的增鲜协同作用，其增鲜程度最高可达到单独使用L-谷氨酸钠的30 倍[28]。2 种蒸煮处理均使5’-鸟苷酸含量有所增加，高压蒸煮增加的更明显，而酶解处理显著降低了呈味核苷酸的含量，这可能是由于酶解使得部分核苷酸受到破坏。

2.4 不同处理方法对草菇中肽分子质量分布的影响

表5 草菇原液及不同制备液的肽分子质量分布Table5 Molecular mass distribution of peptides in mushroom homogenate before and after different treatments

由表5可以明显看出，不同提取方法得到的制备液中肽的分子质量分布明显不同。和原液相比，常压蒸煮、高压蒸煮和酶解作用后，小于500 Da组分的含量都有增加，高压蒸煮制备液增加的最显著，这是因为高温高压的条件使得大分子分解成小分子的程度大。

氨基酸的分子质量一般都小于500 Da，即3 种不同提取方法处理后，氨基酸的含量都有所增加，以高压蒸煮的增加最为明显，这与游离氨基酸的分析结果一致。另外，食用菌味道鲜美是源于其含有许多鲜味物质，呈味肽就是一类重要的风味物质，呈味肽是一类分子质量小于3 000 Da的寡肽[29]，这类肽组分可与舌头味蕾上某一味道的特异性受体相互作用，呈现特征滋味[30]。由表5可以看出，高压蒸煮制备液中，小于3 000 Da的组分含量最多，因此，通过高压蒸煮获得呈味肽是有效途径之一。

3 结 论

经过常压蒸煮、高压蒸煮、复合酶解3 种不同提取方法获得的制备液，呈味物质都有一定的变化，3 种不同的提取方法对草菇呈味物质释放的影响不尽相同。和原液相比，常压蒸煮制备液可溶性糖的总量显著降低，这可能是还原糖参与美拉德反应导致的；高压蒸煮制备液可溶性糖的总量和草菇原液基本相同；而由纤维素酶和风味蛋白酶分步酶解作用显著地提高了可溶性糖的总量，主要表现为葡萄糖含量的明显增加。从有机酸的变化来看，和原液相比，常压及高压蒸煮制备液有机酸总量显著增加，尤其是高压蒸煮；而复合酶解制备液有机酸含量显著降低，主要是由其苹果酸和柠檬酸的含量显著降低所致。从游离氨基酸总量上看，不同方法处理后的游离氨基酸总量都有所增加。3 种处理方法相比，蒸煮获得的游离氨基酸更多，尤其是高压蒸煮，这主要是因为高温高压对植物细胞壁的降解作用更剧烈，使更多的游离氨基酸释放出来。其中高压蒸煮制备液的鲜味氨基酸、甜味氨基酸以及苦味氨基酸的含量都增加的最为显著。草菇中只检测出5’-鸟苷酸对鲜味有贡献的呈味核苷酸，2 种蒸煮处理都使5’-鸟苷酸含量有所增加，高压蒸煮增加的更明显，而酶解处理显著降低了呈味核苷酸的含量。不同提取方法得到的制备液中肽的分子质量分布明显不同。和原液相比，常压蒸煮、高压蒸煮和酶解作用后，小于500 Da组分的含量都有增加，以高压蒸煮的增加最为明显。高压蒸煮制备液中，小于3 000 Da的组分含量最多，是制备呈味肽有效的处理方法之一。

综上，本实验通过研究不同处理方法对草菇中呈味物质释放的影响，为草菇深加工产品的开发以及食用菌调味料的研究提供了一定的理论基础。

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