王宏飞 罗琼, 李延鹏 同戈 张晓楠 朱启运 李慧敏 陈瑞爱,

1.肇庆大华农生物药品有限公司

2. 华南农业大学

3.中国农业科学院兰州兽医研究所

新城疫是危害我国养禽业最严重的疫病之一，该病为OIE所规定的动物必报疫病，也是我国规定的一类动物疫病，世界各国对该病的防控和研究一直十分重视。目前我国防控新城疫主要使用La Sota和Clone30两种疫苗株，二者均属于基因Ⅱ型；而田间流行的毒株主要是基因Ⅶ型NDV，所以上述两种疫苗不能在临床应用上提供高效的免疫保护，虽然不出现严重临床症状和死亡，但其组织器官在强毒感染下仍然会产生较严重的病变。而使用相同基因型的疫苗，不仅能有效降低攻毒后试验动物的排毒率，而且能显著减少喉气管和泄殖腔中的病毒含量。使用与流行基因型一致的疫苗株来防控新城疫，对于有效控制疫病的发展具有绝对优势。利用反向遗传操作技术，将NDV的主要毒力基因F进行突变，将G7株的F蛋白裂解位点（RRQKRF）突变为La Sota弱毒株的裂解位点（GRQGRL），并在此基础上，将NP蛋白的优势抗原表位第443-460位氨基酸进行缺失，获得双突变株MG7，鸡新城疫灭活标记疫苗（MG7株）是与当前我国流行株匹配的新型新城疫灭活疫苗。

本实验室前期研究表明，利用鸡新城疫灭活标记疫苗（MG7株）免疫SPF鸡，20μl即可达到理想的保护效果，攻毒试验结果显示，不同日龄（10日龄和30日龄）SPF鸡群均能抵抗流行的基因Ⅶ型强毒G7的攻击，显示出了该疫苗在控制我国新城疫的流行中具有广阔的应用前景，本研究利用新兴土鸡2号研究了鸡新城疫灭活标记疫苗（MG7株）在商品鸡中的免疫持续期，以期为制定合理的疫苗免疫程序提供参考。

一、材料和方法

1.疫苗。肇庆大华农生物药品有限公司中试生产的鸡新城疫灭活标记疫苗（MG7株）。市售同类疫苗为鸡新城疫灭活疫苗（La Sota株）和基因Ⅶ型重组新城疫病毒灭活疫苗（A-Ⅶ株）。

2.试验鸡。新兴县稔村温氏家禽有限公司饲养的40日龄新兴土鸡2号。

3.验用强毒。NDV强毒北京株（CVCC AV1611）（购自中国兽医药品监察所）和基因Ⅶ型G7株（兰州兽医研究所和肇庆大华农生物药品有限公司保存）。

4.检测用抗原。MG7抗原由肇庆大华农生物药品有限公司保存。

二、试验方法

1.鸡新城疫灭活标记疫苗（MG7株）免疫后的血清学检测。取40日龄新兴土鸡2号（1-40日龄时均按鸡场正常免疫程序进行免疫）180只在隔离器饲养。在40日龄进行新城疫疫苗免疫，剂量均为单次免疫剂量0.5 ml，第1组随机抽取40只免疫鸡新城疫灭活标记疫苗（MG7株），第2组随机抽取40只免疫市售La Sota疫苗，第3组随机抽取40只免疫市售（A-Ⅶ株）疫苗，第4组为剩下60只作空白对照，在免疫前采血，免疫后的1、3、4、5、6、8个月分别对免疫鸡群抽样采血，每组采20份血样，分离血清，用MG7抗原检测HI抗体效价，确定试验疫苗的免疫持续期。

2.鸡新城疫灭活标记疫苗（MG7株）免疫后的攻毒试验。40日龄新兴土鸡2号免疫后6个月，抽取方法2.1分组的免疫鸡新城疫灭活标记疫苗（MG7株），La Sota株疫苗、（A-Ⅶ株）疫苗组各20只；另从对照组抽取20只作为攻毒对照组，另外20只作为空白对照组。采集血清后，免疫组和攻毒对照组（各20只）再分成2组，每组10只，第1组每只鸡肌肉注射新城疫病毒北京株（CVCC AV1611）0.5 ml(含 105.0ELD50)，第 2组每只鸡肌肉注射新城疫基因Ⅶ型G7株强毒0.5 ml(含105.0ELD50)，观察14日，记录鸡群的精神、采食、死亡等情况，攻毒后5日采集泄殖腔拭子接种SPF鸡胚进行病毒分离，对病毒分离阴性的，应在SPF鸡胚再盲传一次后进行判定。方法如下：泄殖腔拭子加入2 ml PBS（含青链霉素8000单位），死亡的鸡采集适量的气管、脾、法氏囊等脏器进行组织研磨，加入2 ml PBS（含青链霉素 8000 单位）。4℃，10000 rpm，离心 10min，取上清经尿囊腔接种于10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2 ml。鸡胚接种后于36℃～37℃孵育120 h，期间每日照胚两次，弃去24 h内死亡胚，24～120 h内死亡鸡胚取鸡胚液，置于2℃～8℃保存。至120 h将存活鸡胚置于2℃～8℃放置4～24 h，收集鸡胚液。检测收集到的鸡胚液的HA效价，每个样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚液的HA价不低于1∶16，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，再盲传一次后再进行判定。盲传后仍为阴性者，方判为病毒分离阴性。

成活率=实验鸡数量-新城疫死亡鸡数量/实验鸡数。

三、试验结果

在免疫前采血，免疫后的1、3、4、5、6个月分别对免疫鸡群抽样采血，每组采20份血样，分离血清检测HI抗体效价，使用MG7抗原作为检测抗原，检测结果见表2，免疫后6个月灭活标记疫苗（MG7株）疫苗组HI抗体为6.4 log2，而市售同类疫苗（A-Ⅶ株）疫苗组HI抗体为 5.2 log2，La Sota 株疫苗疫苗组 HI抗体仅为 4.1 log2。

表1 40日龄新兴土鸡2号免疫后效力结果（免疫 0.5 ml，N=20）

40日龄新兴土鸡2号免疫后6个月进行攻毒实验，攻毒对照组鸡有明显精神不振、嗜睡，拉黄绿色稀粪等典型新城疫临床症状，3～5 d内全部死亡。La Sota株疫苗组在肌肉注射新城疫基因Ⅶ型G7株强毒后，有两只在第三天出现精神不振并在第5 d死亡，其余免疫攻毒组与空白对照组无明显差异且全部健活。实验结果表明免疫后6个月，免疫组鸡能有效抵御新城疫强毒G7株和北京株的攻击（见表2）。用北京株攻毒，3种疫苗免疫后成活率均为100%，病毒分离结果，La Sota株疫苗免疫组全部阴性，（MG7株）和（A-Ⅶ株）疫苗免疫组各分离1个阳性。用G7株攻毒，鸡新城疫灭活标记疫苗（MG7株）和（A-Ⅶ株）疫苗免疫组成活率为100%，La Sota株疫苗免疫组成活率为80%，攻毒对照组全部死亡；攻毒后5日采集泄殖腔拭子进行病毒分离，MG7免疫组病毒分离全部阴性，La Sota株疫苗2个阳性，（A-Ⅶ株）疫苗免疫组1个阳性，保护效果略优于市售同类产品。

表2 新兴土鸡2号免疫攻毒保护实验结果

四、讨论

家禽养殖业用于防控新城疫的主要策略是疫苗接种，目前国内外使用的疫苗株La Sota为基因II型，距今已有70多年的历史，有研究表明La Sota疫苗株与目前流行的新城疫病毒株在遗传上有很大程度分歧。本研究利用新兴土鸡2号研究了鸡新城疫灭活标记疫苗（MG7株）在商品鸡中的免疫持续期，同时以市售同类疫苗鸡新城疫灭活疫苗（La Sota株）和基因Ⅶ型重组新城疫病毒灭活疫苗（A-Ⅶ株）为对照，统一用MG7抗原进行HI抗体检测，检测结果发现La Sota株疫苗组抗体要低于MG7株疫苗组。本实验室前期研究分别以MG7株和La Sota株抗原对在SPF鸡免疫MG7和La Sota疫苗后获得的阳性血清进行了交叉HI检测。MG7株疫苗免疫血清抗体以MG7抗原进行检测时，滴度为6.3 log2，以La Sota抗原进行检测时，抗体滴度仅为为4.4 log2；La Sota株疫苗免疫血清以La Sota抗原进行检测时，抗体滴度为5.9 log2，以MG7抗原进行检测时，抗体滴度仅为4.7 log2（未发表资料）。结果表明，利用不同基因型新城疫抗原检测，抗体相差1～2个滴度（log2）其抗原检测同源血清时，抗体滴度较高。本研究结果显示La Sota株疫苗抗体要低于MG7株疫苗的抗体，结果可能与异源抗原（MG7抗原）检测有关，不同新城疫病毒基因型间抗原抗体交叉反应的差异型也进一步说明需要研发新的基因型相匹配的新城疫疫苗。

常规使用剂量（0.5 ml）免疫后测定新城疫灭活标记疫苗（MG7株）在商品鸡中的免疫持续期，免疫后抗体在一个月达到高峰，达到9.1 log2，随后抗体逐渐衰减，6个月时HI抗体检测值为6.4 log2，用田间分离的NDV基因VII型强毒G7和传统强毒北京株分别进行攻毒实验，结果表明，单剂量免疫后持续期可达6个月，6个月时攻毒对G7株均能提供100%保护，北京株强毒攻毒后也是100%的成活率。而La Sota株疫苗在G7株攻毒后仅能提供80%的保护。尽管常规ND疫苗免疫后能够降低发病率和死亡率，但不能有效阻止鸡只继续感染和向环境中排毒，传播疫病。本研究在MG7株免疫6个月后用基因Ⅶ型G7强毒株和进行攻毒实验，La Sota株免疫组在攻毒后有20%的鸡分离到病毒；而MG7株免疫组在攻毒后未能检测到病毒，表明在我国以基因Ⅶ型为流行株的环境下，相比传统的La Sota疫苗，MG7株可更有效保护鸡群并阻止排毒。

商品鸡中的结果进一步表明，新城疫灭活标记疫苗（MG7株）具有良好的预防新城疫的作用。为了获得比较理想的保护效果，建议商品鸡在免疫新城疫灭活标记疫苗（MG7株）5个月时，加强免疫1次。

参考文献（略）