马建苹，魏永威，李善家，郭涛，晋玲

1兰州理工大学生命科学与工程学院，兰州730050；2甘肃省中藏药筛选评价及深加工重点实验室，兰州理工大学，兰州 730050；3甘肃中医药大学药学院，兰州730000

基金项目：甘肃省自然科学基金（No.1606RJZA207）

藿香（Agastache rugosa）唇形科藿香属多年生草本植物，是我国常用的芳香化湿类中药，全草入药，有止呕吐，治霍乱腹痛，驱逐肠胃充气，清暑等功效；果可作香料，叶与茎均富含挥发性芳香油，有浓郁的香味，是芳香化湿类中药[1]。现代药理学研究表明藿香具有抗炎、抗菌等作用[2]。藿香全草中所含有的挥发油成分能够促进胃肠道蠕动，分泌胃液，促进人体对食物的吸收。还有扩张血管，促进排汗，能够有效缓解因排汗不利所引起的慢性疾病。近年来，药用植物内生真菌的研究已逐渐受到人们的广泛关注，藿香主要是利用栽培技术提供药用资源，目前国内外关于藿香内生菌的研究鲜见报道，本实验以藿香的内生真菌进行了研究。通过对藿香茎部位内生真菌的分离纯化，确定茎部位内生真菌的种类和数目，用形态学手段对所分离的菌株进行初步鉴定。并且对分离得到的所有内生真菌进行发酵，所得发酵产物进行进一步抗氧化活性测定，筛选出活性较好的菌株，为开发潜在的抗氧化剂提供理论基础。

1.材料及仪器

1.1 材料与仪器

植物采集于甘肃省兰州市石佛沟，经甘肃中医药大学晋玲教授鉴定为藿香Agastache rugosa 。超净工作台、光学显微镜、恒温振荡培养箱、高压灭菌锅等常用仪器；实验所用药品试剂均为国产分析纯。

1.2培养基配制 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：去皮马铃薯200g，煮沸30min，8层纱布过滤，加入葡萄糖20g，定容至1000mL，然后加入1.5 % ～ 2 %的琼脂。

马铃薯葡萄糖培养基(PDB)：去皮马铃薯200g，煮沸30min，8层纱布过滤，加入葡萄糖20g，定容至1000mL，121℃灭菌30min，待冷却以后分别加入200µL 100µg/mL的青霉素和硫酸链霉素。

2.方法

2.1 内生真菌的分离

组织分离法：取干燥洗净的藿香茎，用解剖刀将藿香茎切成0.5cm×0.5cm×0.5cm小块。在无菌条件下用75%乙醇、0.1%升汞消毒，每次用消毒剂消毒后都用无菌水冲洗3次，放在无菌的滤纸上吸干。用无菌的镊子将材料的横切面接入PDA培养基，以最后1次表面消毒冲洗后的无菌水作为参照，28℃恒温培养3～7d。待内生真菌长出后，观察菌落形态特征，重复画线纯化[3]。

2.2 内生真菌的初步鉴定

插片法：将内生真菌接种到平板上，插上灭菌的盖玻片，28℃培养，生长完全后放于载玻片上经过棉兰染色后，在光学显微镜下观察菌落、菌丝体、孢子形态[4]。根据《真菌鉴定手册》 初步鉴定。

2.3 内生真菌次级代谢产物DPPH·自由基清除活性测定

将纯化好的内生真菌适量接种于PDB培养基，28℃、120rpm培养7d。分离菌丝体和发酵液，发酵液用乙酸乙酯和正丁醇分别萃取3次，合并、减压蒸干，得到乙酸乙酯和正丁醇萃取部位；菌丝体冷冻干燥后用乙醇加热回流提取2h，减压蒸干，得到菌丝体乙醇提取部位。

在试管中分别加入2mL 0.025mg/mL 的DPPH·乙醇溶液和2mL 0.1mg/mL样品溶液，避光反应30min，用无水乙醇做参比溶液，在517nm处测定吸光度A样品。为了排除乙醇和水对实验结果的影响，用水和乙醇作为阴性对照，Vc水溶液作为阳性对照[8-9]。每个样品平行做两次，计算平均值。

式中：A样品-加入样液后DPPH·乙醇溶液的吸光度；A对照-无水乙醇和样液混合后的吸光度；A空白-未加样液的DPPH·乙醇溶液的吸光度。

3.结果

3.1 内生真菌的分离和初步鉴定

从藿香茎中共分离出8株内生真菌，初步鉴定出7株，分别是HX-J1为短梗霉属(Aureobasidium sp.)，HXJ3、HX-J4为交链孢菌属(Alternaria sp.)，HX-J2为葡柄霉属(Stemphyliumsp.)，HX-J6、HX-J7为刺盘孢菌属(Colletotrichumsp.)，HX-J8为棒孢霉属(Corynesporasp.)其中HX-J5未鉴定出结果。

表1 内生真菌菌株编号及初步形态学观察

3.2 内生真菌次级代谢产物对DPPH·自由基的清除能力

DPPH· (2,2-二苯代苦味肼基) 是一种稳定的自由基，能与乙醇结合形成深紫色溶液，在517 nm处有强吸收，如果有电子配对，则吸收减弱或消失，其褪色程度与电子数成量化关系，因此用分光光度计进行定量分析。吸光度值越小，清除率越大，样品DPPH·自由基清除活性越强[6]。

通过测定DPPH·自由基的清除活性，结果表明：样品对DPPH·自由基均有不同程度的清除活性，清除率超过80%的有HX-J5、HX-J6、HX-J7的乙酸乙酯部位，其中HX-J7的乙酸乙酯部位对DPPH·自由基清除活性较强，达到97.44%，与阳性对照Vc（97.80%）的活性相当；HX-J3的正丁醇部位对DPPH·自由基清除活性达到54.50%；乙醇提取部位以及水部位清除率均低于50%，因此活性较低。

图1.藿香内生真菌次级代谢产物清除DPPH·自由基活性测定结果

4.结论与讨论

本实验从藿香植物的茎中根据菌落形态特征的不同共分离得到8株内生真菌，经过形态学初步鉴定7株属于2纲、2目、4科、5属，分别是HX-J1为短梗霉属(Aureobasidiumsp.)、HX-J3、HX-J4为交链孢菌属(Alternariasp.)、 HX-J2为葡柄霉属(Stemphyliumsp.)、HX-J6、HX-J7为刺盘孢菌属(Colletotrichumsp.)、HX-J8为棒孢霉属(Corynesporasp.)其中HX-J5未鉴定出结果。藿香内生真菌种类丰富，各类群的数量繁多，主要以拟茎点霉属 、刺盘孢属和镰刀菌属为优势菌株，但同时也分离出弯孢属、黑孢属、曲霉素等具有代表性菌属。因此人们在寻找不同培养基的同时优化分离技术，不断完善研究方法。实验由于只运用马铃薯葡萄糖培养基，所以得到的内生真菌数量与种类有限，组织中分离的菌株种属比较局限，为分离出更加丰富的内生真菌种类，显示植物内生真菌的多样性，后期将继续完善内生真菌分离技术，辅以其他真菌培养基和消毒方法，以期获得更多的内生真菌。

本研究采用DPPH·自由基清除活性试验测定藿香内生真菌次级代谢产物的抗氧化活性，结果表明次级代谢产物中乙酸乙酯部位表现出相对较好的活性，尤其HX-J7的清除活性优于其他菌株。为进一步分离纯化活性次生代谢产物及其生物活性评价提供参考和帮助。