刘志芳， 严 红， 郑荣泉，3， 张启鹏， 梅祎芸，王志刚， 洪 燕， 周婷婷

(1.浙江师范大学 野生动物保护与利用技术中心,浙江 金华 321004；2.浙江师范大学 野生动物生物技术与保护利用浙江省重点实验室，浙江 金华 321004；3.浙江师范大学 行知学院，浙江 金华 321004)

环境雄激素主要包括天然雄激素与合成雄激素.天然雄激素包括睾酮(testosterone)及其衍生物雄酮(androsterone)、雄烯二酮(androstenedione)等.天然与合成雄激素类物质是一类典型的内分泌干扰物[1-2].环境雄激素可干扰水生生物正常的内分泌系统，引起雄性比例偏高、雌性出现雄性第二性征、卵精巢和卵黄蛋白原的诱导受抑制、生殖能力下降等[3-5]，也可引起哺乳动物出现雄性化特征[6-8].17α-甲基睾酮(17α-methyltestosteron，MT)，又名甲基睾丸素或甲基睾丸酮，是一种人工合成的雄性激素，能促进雄性性器官发育成熟和第二性征的形成和维持.实验已经证实，不同浓度的 MT 对不同鱼类有不同的生物学效应[9].低浓度 MT 可促进鱼类生长，然而高浓度 MT 则导致鱼类的畸形和死亡[10].对该化合物内分泌干扰效应的研究结果还显示，MT 能改变鱼类的性别，导致雌鱼雄性化[11].在MT 对食蚊鱼(Gambusiaaffinis)形态雄性的研究中显示，MT 的雄激素效应明显，可导致雌鱼在生长发育过程中出现形态雄性化[12].对于已分化的性腺，外源激素可改变鱼类个体的副性征、性行为及导致败育或不育[13].在较低等的生物中，外源激素还可以引起性腺的再分化[14]，进而改变个体的性别[15-16].

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)是我国特有的两栖动物，俗称石蛙、石鸡，分布于我国长江以南地区的山涧溪流中[17].棘胸蛙药食两用，据《本草纲目》[18]记载,石蛙具有较高的药用价值，可以作为医用辅助中药，具有强身健体、降血压、清解热毒、降血脂等功效，素有“百蛙之王”的美名.棘胸蛙的养殖规模随着市场需求逐步扩大，棘胸蛙对养殖条件、生活环境等要求较高，同时也受到种源及技术等限制，近年内难以形成一定的生产规模[19].棘胸蛙存在两性异形，雄体大于雌体[20].因而棘胸蛙的高效养殖模式及单性养殖技术在棘胸蛙生产中显得尤为重要.本试验用不同剂量MT饲料饲喂棘胸蛙小蝌蚪，通过组织学方法观察性腺变化，探讨外源雄性激素对棘胸蛙生长发育及性腺的影响，为棘胸蛙的单性养殖及规模化生产提供理论及技术基础.

1 材料与方法

1.1 实验动物

棘胸蛙来自浙江金华绿谷清泉生态石蛙养殖场和建德市鑫泉金石蛙生态养殖场.在棘胸蛙的繁殖季节(2014，2015年的4—9月)，将不同亲本同一天产出的受精卵混合放到孵化箱中流水自然孵化，密度为1 000 卵粒/m3水体，培养温度控制自然水温(22～24 ℃)，观察胚胎发育，蝌蚪孵出后带回实验室中进行实验.

1.2 实验试剂

17α-甲基睾酮购于山东西亚化学工业有限公司，纯度98%.

1.3 实验方法

采用乙醇喷雾法将MT溶解于95%乙醇，之后将溶有MT的酒精和在牛蛙蝌蚪饲料里，再将饲料放入40 ℃烘箱中烘干后投喂.设置10，30，50 mg/kg实验组和0 mg/kg对照组，对照组用不含MT的相同体积的95%乙醇来处理.每组随机分得同一批次刚孵出蝌蚪100尾；蝌蚪每天定时定点投喂1次处理过的高蛋白牛蛙蝌蚪饲料，投喂量为蝌蚪体重的3%～5%，同时每隔5 d投喂1次植物性饵料(蒸熟的苦麻叶)，以增强蝌蚪的抵抗力，投饲相应饵料至蝌蚪变态为止；实验期间，用吸水泵清除水槽底部的粪便和剩余饲料，每次吸出一半培养用水，再补充等量经过充分曝气的自来水，水温控制在22～24 ℃.实验期间每组水体中放入增氧泵时刻增氧，并用净水器形成循环流水，在养殖箱中放置1～2片瓦片遮阴，形成山涧流水环境来提高蝌蚪的生长条件.

在饲养60 d时，各浓度组蝌蚪都无变态，此时测量各浓度组蝌蚪的体长体重，记录实验数据.自第1只蝌蚪开始变态后，每天定时记录每组蝌蚪的变态情况.同时在实验期间，记录每组蝌蚪的死亡、变态畸形等.

1.4 组织学分析

发育85 d的蝌蚪统计完实验数据后，切去蝌蚪尾巴及透明口部，将躯干固定于FAA液中固定3～4 h，做常规石蜡切片，经HE染色在生物显微镜下观察照相.

1.5 数据处理和统计分析

2 结果与分析

2.1 MT对蝌蚪体重体长的影响

各浓度组棘胸蛙蝌蚪饲喂60 d后都没有变态的情况，但是体长生长速度呈现出与剂量相关的减少趋势.最高浓度组(50 mg/kg)体长与对照组相比差异极显著(P<0.01)，其他浓度组体长与对照组相比也显著减少(P<0.05)(见表1).表明MT对棘胸蛙蝌蚪的体长有一定的抑制作用.体重同样呈现出与剂量相关增长率的减少趋势(见表1)，但差异不显著(P>0.05).

表1 MT对棘胸蛙蝌蚪体重体长的影响

注：同列数据后大写字母不同表示差异极显著(P<0.01).

2.2 MT饲喂对蝌蚪发育时间的影响

与对照组相比，10,30 mg/kg处理组蝌蚪变态周期均没有显著变化(P>0.05)，只有50 mg/kg组蝌蚪变态周期显著缩短(P<0.01)(见表2).表明高浓度MT激素效应明显，能加快蝌蚪的变态发育.

表2 MT对棘胸蛙蝌蚪发育时间的影响

注：同列数据后小写字母不同表示差异显著(P<0.05)；同列数据后大写字母不同表示差异极显著(P<0.01).

2.3 MT饲喂对蝌蚪成活率、变态率、畸形率的影响

统计各组棘胸蛙蝌蚪的成活率、变态率、畸形率(见表3).与对照组相比，各实验组蝌蚪的成活率显著降低(P<0.01)，说明MT对棘胸蛙蝌蚪有致死效应；MT对棘胸蛙蝌蚪的畸形率影响较大，各实验组与对照组间存在极显著性差异(P<0.01)，畸形表现为蝌蚪变态不完全，前肢残缺或长不出前肢，跳跃有障碍，变态成幼蛙后易死亡.与对照组相比，各浓度组对蝌蚪变态率没有引起显著差异(P>0.05).表明棘胸蛙蝌蚪的变态率不受MT影响.

表3 MT对棘胸蛙蝌蚪的成活率、变态率及畸形率的影响

2.4 MT饲喂对蝌蚪雌雄比例的影响

对同一变态时期蝌蚪的性腺进行切片观察，统计性腺切片发现，雄性率与MT浓度呈正相关趋势.为获得最佳观察视野和观察效果，对性腺切片放大不同倍数进行观察发现，除了正常性腺(见图1)之外每个实验组均出现中间形态性腺，表现为一边精巢一边卵巢或一个性腺上既有精原细胞又有卵原细胞(见图2).10 mg/kg MT含量实验组雄性率为52.8%，切片有2只中间形态的性腺；30 mg/kg MT含量实验组，雄性率为62.0%，切片有4 只中间形态的性腺；其中最高浓度组雄性率达66.0%，与对照组相比有显著性差异(P<0.05)，切片有5 只中间形态的性腺(见表4).其中图中字母分别表示:Ac：腹腔；Da：背主动脉；G：消化道；M：中肾；Md：中肾管；Mu：肌肉；O：卵巢；Oo：卵原细胞；PGC：原生殖细胞； Sp：脊柱；Sc：次生性腔；Sg：精原细胞；T：精巢；Vi：内脏.

表4 MT对棘胸蛙性比的影响

(a)0 mg/kg MT组性腺横切面，示放大25倍的正常发育卵巢；(b)50 mg/kg MT组性腺横切面，示放大100倍的正常发育卵巢；(c)10 mg/kg MT组性腺横切面，示放大25倍的正常发育精巢；(d)0 mg/kg MT组完成变态幼蛙性腺横切面，示放大100倍的正常发育精巢

图1 蝌蚪正常性腺切片

(a)50 mg/kg MT组性腺横切面，示放大50倍一侧性腺为精巢；另一侧仍含有卵原细胞的精巢;(b)30 mg/kg MT组性腺横切面，示放大200倍含有卵原细胞的精巢，性腔未消失

3 讨 论

3.1 MT对棘胸蛙生长发育的影响

激素诱导一直是激发经济动物生长潜能的重要方式.在鱼类，激素存在抑制或促进生长两种情况.据报道，睾酮能够促进雌性日本粗皮蛙卵巢向着精巢大小方向发展[21].本研究采用不同浓度MT饲喂棘胸蛙蝌蚪，导致蝌蚪体长呈现与剂量相关的负增长关系，体重没有表现出明显的差异.实验期间，高浓度组蝌蚪生长速度加快，变态周期缩短，提前进入变态期.表明高浓度MT能够抑制蝌蚪的生长速度，体重、体长的减小所释放的能量可能用于蝌蚪的快速生长，使其快速完成变态.

对鱼类激素诱导性别转化的研究显示，性别逆转的动物其存活率普遍较低[22]，表明遗传型与表现型不相同的物种很容易死亡.激素处理强度表现为激素的使用剂量和持续处理时间2个方面及二者的交互作用.激素诱导作用具有阈值，作用效果在阈值以内时，没有显著影响力，当激素处理强度超过这个阈值后就会导致鱼类的成活率明显降低[23].到目前为止，尚未有报道性激素处理导致成活率升高的现象.本实验研究表明，MT可降低棘胸蛙蝌蚪的成活率，但各处理组的成活率的差异性不显著，可能是MT浓度或处理时间没有达到致死率最高的阈值.本实验中各实验组与对照组相比，畸形率显著增高.由于畸形的幼蛙不具备跳跃捕食的能力，一般都会在完全变态后几天内死亡，造成死亡率升高的原因与MT影响下畸形率升高有一定联系.

3.2 MT对棘胸蛙性腺分化的影响

已有研究表明，外源激素MT除了可以促进正常的性腺分化外，还可使性腺出现畸形，如精巢中出现卵巢腔、性腺导管发育不全或消失、卵巢与精巢组织出现在同一个体中(兼性鱼)、性腺萎缩和生殖细胞退化或消失(不育鱼)、性腺发育抑制等[24].有研究报道，不同含量MT对黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)雄性率影响不大，但每个含量组都有双性鱼的出现[25].在本实验中，MT也导致蝌蚪中有中间性腺的现象，同一蝌蚪中既有精巢又有卵巢，在10，30和50 mg/kg组，中间态个体均有出现.中间态的蝌蚪的性腺可能正处于逆转时期.MT 已被认为是一种有效的性腺转化诱导剂，鱼类在自然性逆转发生之前的任何年龄阶段用其处理均可诱导转雄[26-27].本研究显示，当浓度达到50 mg/kg时，其雄性率显著升高，而低浓度MT组雄性率无显著变化.表明高浓度MT可诱导棘胸蛙雄性化.

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