徐江民， 蒋玲欢， 沈晨辉， 胡瑚倩， 林 晗， 马 路， 饶玉春

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

衰老是生物有机体发育的必经阶段，也是一个高度程序化的过程，对植物来说，通过这个过程可将衰老叶片中营养物质分解并转运至生长旺盛的果实或种子等.叶片是水稻(Oryzasativa. L)重要的源器官，其功能及生长进程对水稻产量与品质有重要的影响.叶片发生衰老时，细胞内自由基产生及清除的动态平衡被破坏，自由基不断积累，从而加剧细胞膜脂过氧化，而作为细胞膜脂氧化产物的丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量也会增加[1].此外叶片中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性不断下降，导致水稻叶片对活性氧的清除能力降低，活性氧积累，使膜脂过氧化作用不断加强，从而促进了衰老[2-3].叶绿体是光合作用的主要场所，一旦叶片衰老，叶绿素含量降低，叶片光合能力将显著下降，直接影响植物的生长量[4].衰老还伴随着抗坏血酸过氧化物酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶含量的减少、活性的降低，抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮含量也会减少等一系列反应[5].

植物激素在调控叶片衰老的启动及进程中发挥着重要的作用[6].其中，一般情况下脱落酸(abscisic acid，ABA)、水杨酸(salicylic acid，SA)和茉莉酸(jasmonates，JA)可以促进叶片的衰老，而通常可以抑制叶片衰老的植物激素有细胞分裂素(cytokinins，CTK)、生长素(auxins)和赤霉素(gibberellins，GA)，这表明叶片的衰老涉及一个复杂的激素调控网络[7].脱落酸在植物生理代谢活动中有重要作用，可减轻环境胁迫对植物的伤害，调控植物衰老[8-9].脱落酸对水稻灌浆的抑制或促进作用与其作用时间、浓度有关，在灌浆初期，脱落酸对籽粒灌浆有促进作用，灌浆后期高浓度脱落酸对灌浆起抑制作用[10].水杨酸是一种植物小分子酚类物质，它能够抑制植物中乙烯的合成，同时又能够促进植物生长过程中SOD和过氧化物酶(POD)的活性，进而抑制脂膜过氧化[11-12].近期研究发现植物激素茉莉酸的自然突变更能阐明茉莉酸在水稻衰老中发挥的作用，证明了甲醇-茉莉酸共同作用与其表观遗传的调控对于水稻叶片的衰老起着重要的作用[13].细胞分裂素延缓叶片衰老的机理之一是负调控叶绿素相关基因的表达，诱导叶绿素分解酶的降解，从而增加叶绿素含量，以维持叶片正常的光合能力[14].生长素在植物的生长发育过程中能提高相关的酶活性，提高源器官光合作用合成同化物的速率，促进同化物运输，提高库容活性[15].在叶片衰老过程中，赤霉素活性成分含量逐渐变低，喷施赤霉素可以延缓叶片衰老进程，所以赤霉素被认为是一类延缓叶片衰老的激素[16-17].

本文以水稻常规品种日本晴NIP及其作为背景的早衰突变体esd1为试验材料，通过在不同时期施加不同浓度的多种外源激素处理后，测定水稻叶片中叶绿素含量、MDA含量、SOD含量等指标的变化，研究外源激素喷施对水稻叶片衰老的影响，找到最适宜的外源激素处理的时期和浓度，观察其各种生理指标的变化.以期为延缓水稻衰老、提高水稻产量和品质的调节提供参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料

水稻常规粳稻品种日本晴(NIP)和由NIP经过EMS (ethylmethane sulfonate，甲基磺酸乙酯)诱变得到的早衰突变体esd1作为本实验的水稻材料.

1.2 方 法

1.2.1 水稻种子的萌发与培养

取各品种的水稻种子200 粒，将水稻种子进行表面消毒(70%乙醇溶液消毒10 min，10%次氯酸钠溶液消毒30 min)，再用去离子水冲洗数次，置于水中浸种2 d，期间换水1次.再进行37 ℃培养箱浸种催芽48 h (用湿毛巾包裹，确保种子的湿度)，待催芽之后挑选露白一致的种子进行播种.

1.2.2 各种外源激素最适浓度的确立

对2个品种的水稻进行常规的水肥管理，在水稻长到三叶期时取长势一致的植株，在大田条件下于7:00用浓度为0，0.05，0.10，0.50，1.00和2.00 μmol/L的外源SA进行喷施处理，同时用浓度为0，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25和1.50 μmol/L的外源独角金内酯GR24也进行喷施叶片处理，在喷施激素后的0，6，12，24，36，48和72 h时分别剪取叶片测其SOD或叶绿素含量，比较不同浓度下2种水稻叶片中SOD或总叶绿素含量的相对变化率，确定最佳处理浓度.当水稻长到灌浆期时，选取长势一致的植株，在大田条件下于7:00用外源生长素2,4-D、ABA、GA3和细胞分裂素KT-30分别进行喷施处理，2,4-D的处理浓度为0，50，200，300，400和500 μmol/L，ABA的处理浓度为0，10，30，50，100，200和400 mg/L，GA3的处理浓度为0，10，50，100和200 mg/L，KT-30的处理浓度为0，0.10，0.50，1.00，2.00和4.00 μg/L，在处理后的0，1，3，5和7 d时分别剪取叶片测其叶绿素a、叶绿素b或MDA含量.比较不同浓度下2种水稻生理指标的相对变化率，最显著的处理浓度为最适处理浓度.

1.2.3 与衰老相关的生理指标测定

叶绿素含量测定的方法参照Arnon分光光度法[18]，MDA含量参照陈建勋等[19]的方法，采用硫代巴比妥酸比色法测定.SOD酶活测定参照Wang等[20]和李合生[21]的方法，即以SOD抑制NBT光化学还原50%所需酶量为一个酶活性单位进行测定.

2 结 果

2.1 外源赤霉素对水稻叶片中MDA含量影响

从图1(a)和图1(b)中可以看出，当GA3的浓度为0 mg/L时，7 d后esd1和NIP中水稻叶片MDA含量均上升.NIP叶片经不同浓度的GA3处理7 d后，与0 d相比,MDA的含量均有所下降，且随浓度的增加，MDA的减少程度呈现出先上升后下降的趋势；esd1的叶片经不同浓度的GA3处理7 d后，与1 d相比,MDA的含量均有所下降，下降趋势与NIP一样，但MDA的下降程度较NIP更为明显.二者均在GA3浓度为50 mg/L时，下降程度最为明显，下降率分别为60.2%和90.6%，可以推测此浓度为外源GA3处理NIP和esd1的最适浓度(见表1).与NIP相比，esd1在GA3浓度为50 mg/L处理时MDA的下降程度更大，因此，esd1表现出对外源GA3更为敏感.

表1 各外源激素处理水稻最适浓度的确定

2.2 外源生长素对水稻叶片中w(叶绿素a∶叶绿素b)的影响

从图1(c)和图1(d)可知，在2,4-D的处理下，2种水稻叶片中w(叶绿素a∶叶绿素b)均有不同程度的增加，且在相同浓度的处理下，除了300 μmol/L浓度组的处理，其余esd1组w(叶绿素a∶叶绿素b)增加明显高于NIP，其中在50 μmol/L浓度的处理下，esd1w(叶绿素a∶叶绿素b)增加量达到最大，达127.5%.而在此浓度下，esd1与NIP的增加程度差异也达到最大，达118.2%.说明发生早衰的esd1对生长素更为敏感，同时也暗示2,4-D对水稻叶片的衰老有抑制作用.在300 μmol/L的处理浓度下，NIPw(叶绿素a∶叶绿素b)的增加最为明显，达到了75.5%，增加程度大于esd1，esd1只增加了36.0%.本研究表明，2,4-D处理的最佳浓度为野生型NIP最适浓度为300 μmol/L，而esd1最适浓度为50 μmol/L(见表1).

图1 多种外源激素处理下NIP和esd1生理指标的变化

2.3 外源独角金内酯对水稻叶片中总叶绿素含量的影响

从图1(e)和图1(f)中可知，经GR24处理72 h后，esd1和NIP的总叶绿素含量变化均不是很明显，但变化过程稍有区别.其中NIP喷施GR24后，72 h内总叶绿素含量呈“M”型变化.喷施不同浓度GR24 6 h后，NIP中总叶绿素含量均有一定程度的上升.而esd1喷施GR24后，72 h内总叶绿素含量呈“W”型变化，在喷施后第一个6 h内，esd1中总叶绿素含量会有一个较为明显的下降过程，后又逐渐上升，在喷施24 h后出现一个较为缓和的下降过程，后又逐渐上升.其中，esd1在浓度为0.50 μmol/L的GR24作用下，总叶绿素含量下降幅度大.这些结果表明,esd1对GR24较为敏感.

2.4 外源细胞分裂素对水稻叶片中MDA含量的影响

从图1(g)和图1(h)中可知，NIP和esd1在未经过KT-30处理时，MDA含量变化趋势不明显.经过不同浓度的KT-30处理后，esd1所有组均呈下降趋势，在0.1 μg/L浓度处理下，水稻叶片MDA值下降程度最大，达72.7%.NIP在不同浓度处理下，相对未处理的均有下降，但是下降幅度不大，其中处理浓度为0.1 μg/L时，MDA下降趋势最大，达9%.总的来说，在经过KT-30处理后，水稻叶片的MDA值均出现了不同程度的下降.但是esd1的叶片MDA值下降程度较NIP更加明显，而且处理时间超过5 d后上升趋势也比NIP的慢.根据以上结果可知,NIP和esd1的最适处理浓度均为0.1 μg/L(见表1).同时表明,esd1对KT-30更为敏感.

2.5 外源脱落酸对水稻叶片中w(叶绿素a∶叶绿素b)的影响

从图1(i)和图1(j)中可知，NIP叶片经浓度为30 mg/L的ABA处理时，效果最好，w(叶绿素a∶叶绿素b)呈上升趋势，其余浓度处理的水稻叶片中w(叶绿素a∶叶绿素b)虽呈下降趋势，但下降趋势逐渐减缓.esd1的水稻叶片中的w(叶绿素a∶叶绿素b)变化趋势与NIP基本相同，但最适处理浓度为100 mg/L(见表1).总的来说，2组水稻经激素处理后，w(叶绿素a∶叶绿素b)下降减缓，但对NIP更为明显，表明esd1对ABA低敏感.

2.6 外源水杨酸对水稻叶片中SOD活性的影响

从图1(k)和图1(l)中可知，经各浓度梯度SA处理，esd1水稻叶片的SOD值在前24 h内几乎无明显变化.大部分浓度的SA在处理24 h后，SOD值有小幅度的升高.且当处理浓度为2 μmol/L时,SOD变化最显著，在处理后12 h内就有较明显的升高，虽然在处理36 h后水稻叶片SOD值有一个明显的下降过程，但在72 h后逐渐上升.NIP水稻叶片的SOD值在经SA处理后仍呈下降趋势，但是在处理24 h后各组均呈上升趋势，其中处理浓度为0.1 μmol/L的水稻叶片的SOD值上升趋势最明显，在处理12 h之后就有一个较明显的上升，但发现esd1叶片中SOD值呈下降趋势.因此，野生型NIP最适处理浓度为0.1 μmol/L，而esd1最适浓度为2 μmol/L(见表1).从各组SOD变化的程度分析，可以认为esd1对SA更加敏感.

3 讨 论

植物的衰老是一个极其复杂的生物学过程，是植物生命周期中必然经历的阶段，除受遗传因素调控外，外部环境因素也会影响其正常的生长发育.其中，植物激素在调控植物衰老的进程中起着很重要的作用，因此，对外源激素影响植物衰老机理的研究是不可或缺的.在本试验中，通过不同浓度的多种外源激素喷施水稻叶片的方法，来探究外源激素在影响水稻生长发育的影响作用.这为植物激素在调控水稻叶片衰老的研究提供一定的参考价值.

本研究中，在未喷施GA3时水稻叶片的MDA含量随着时间的推移而逐渐上升，而喷施GA3后对应品种的叶片内MDA含量总体呈下降趋势，暗示了GA3能通过某些生化途径来抑制水稻叶片中MDA的产生，从而延缓叶片衰老.与NIP相比，esd1表现出对GA3更敏感，推测esd1突变体影响了GA的信号传导途径.生长素对叶片衰老的调节作用通过应答和编码生长素相应因子或吲哚乙酸蛋白来实现，生长素在叶片衰老过程中可以有效抑制衰老基因表达，从而维持细胞活性来延缓衰老[22].本研究通过喷施2,4-D可以提高水稻叶片中w(叶绿素a∶叶绿素b)，esd1在低处理浓度下就表现出异常敏感反应，说明esd1对2,4-D更敏感.推测esd1突变体衰老相关基因的表达升高而表现出早衰表型，外源喷施2,4-D可以有效延缓衰老的发生.通过喷施KT-30来统计分析叶片中MDA含量的变化，结果发现在很低浓度处理下esd1突变体就表现出叶片中MDA含量急剧下降的敏感反应.推测这可能与esd1突变的分子机制有关，导致其对KT-30的敏感反应增强.在灌浆初期外源喷施不同浓度ABA，发现在低浓度处理下对w(叶绿素a∶叶绿素b)影响不大，在较高浓度下处理，发现NIP和esd1w(叶绿素a∶叶绿素b)呈下降趋势，由此推断，外源ABA能促进叶片的衰老，会推进库源转运的进程.在水稻三叶期时喷施SA，结果发现NIP和esd1的SOD含量均呈上升趋势，但SOD变化趋势与实验预期存在差异，这可能是因为我们处理的水稻处于三叶期，胚中的营养物质充分，足以保证水稻生长到五叶期，因此叶片还未呈现出衰老状态，SOD含量并不会产生特别明显的变化.另外，本研究也进行了喷施GR24处理，发现与衰老相关的生理指标没有太大的变化，这可能与喷施的时期有关.据陈小娟研究发现，独脚金内酯位于生长素的下游，其作为第二信使，对水稻的衰老的调控需要较长一段时间来体现[23].由于受种种条件所限，我们所选的实验周期较短，可能不足以体现独脚金内酯对延缓水稻衰老所起的作用效果.然而考虑到外源激素对水稻叶片衰老作用的延缓具有时效性[24]，仍要经过大量的实验才能得出合适的处理周期，并得到更令人满意的结果.

整体上看，喷施外源激素对延缓水稻衰老具有一定的可行性效果，并且esd1对多种外源激素更为敏感.这些结论可以为水稻叶片发生早衰的品种延缓衰老提供理论支持.下一步笔者将通过分子水平上探究多种植物激素是如何参与调控植物叶片衰老的，分析esd1基因参与的信号通路，初步探明水稻早衰发生的分子机制和激素间的遗传调控网络.

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