微波辅助水解法测定鱼鳞中羟脯氨酸

2018-05-31王振雷吉林省辽源市食品质量安全检测中心

食品安全导刊 2018年12期

□ 姜珊王振雷吉林省辽源市食品质量安全检测中心

鱼鳞中的胶原蛋白是生物体内一种重要的蛋白质，也是结缔组织的重要蛋白成分，水产胶原蛋白具有比陆生动物胶原蛋白更高的安全性和更多的优点。胶原中约50%的脯氨酸被羟基化成为4Hyp和少量3Hyp。作为氨基酸的主要组成部分而存在胶原蛋白中，约占胶原蛋白总量的10%，但不存在于一般蛋白质中，通过测定羟脯氨酸的含量再乘以相应的系数就可以得到胶原蛋白的含量。

本研究旨在找到一个微波辅助水解鱼鳞测定鱼鳞中羟脯氨酸的最佳实验条件，为鱼鳞蛋白水解提供一个确切的羟脯氨酸测定标准，并为鱼鳞中羟脯氨酸的开发利用提供一个科学有效的理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

数显恒温水浴锅HH-4（国华电器有限公司）、电子天平FA2104（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、分光光度计723A（上海精密仪器科技有限公司）。

1.2 材料与试剂

原料：新鲜鲫鱼鱼鳞。试剂：10%NaCl溶液、盐酸、L-羟脯氨酸、高氯酸、醋酸钠、柠檬酸三钠、柠檬酸、异丙醇、对二甲氨基苯甲醛均为国产分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 鱼鳞预处理及脱钙

取新鲜鲫鱼鱼鳞，用10%的中性NaCl溶液浸泡10 h并去除杂蛋白和鱼银，晾干备用，加入0.4 mol/L的盐酸进行20 min脱钙，烘干制粉备用。

1.3.2 试验试剂的配制

醋酸-柠檬酸缓冲溶液（PH=6）的配制：57 g醋酸钠、37.5 g柠檬酸三钠、5.5 g柠檬酸和385 mL异丙醇一起定容于1 000 mL容量瓶保存。测定前将7%氯胺-T溶液和醋酸柠檬酸缓冲液按1∶4体积混合，得氧化剂溶液（A液）。

显色剂的配制：取10 g对二甲氨基苯甲醛溶解于15 mL高氯酸水溶液中，于测定前将对二甲氨基苯甲醛溶液和异丙醇3∶13体积混合，即显色剂溶液（B液）。

1.3.3 标样曲线的绘制

称取L-羟脯氨酸制0.054 5 g/L羟脯氨酸标准溶液。分别取3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL，溶液定容到10 mL容量瓶中，分别加入1 mL柠檬酸缓冲液和1 mL 0.05 mol/L氯胺-T溶液，室温（25 ℃）氧化10 min后，加入高氯酸1 mL，放置10 min，最后加入对二甲基氨基苯甲醛显色试剂1 mL，在65 ℃水浴显色10 min，冷却后在561 nm处测吸光度，绘制标准曲线。

1.3.4 微波辅助法水解试验设计

分别称取5份10 g鱼鳞样品于250 mL锥形瓶中，加入20 mL盐酸，放入微波炉中进行微波处理。趁热将水解产物转移至250 mL容量瓶中，用10 mL盐酸分三次洗涤锥形瓶，用水定容，摇匀。准确移取6 mL上述溶液于100 mL容量瓶中，用水定容，加入3 mL氧化剂溶液（A液）氧化10 min后，加入高氯酸1 mL，放置10 min最后加入B液1 mL，在65 ℃水浴显色10 min，冷却后在最高吸收峰561 nm处测吸光度测定其吸光度。通过单因素和正交试验考察微波时间、微波功率、盐酸浓度对测定羟脯氨酸的显著影响，并确定水解条件的最佳组合。

2 结果与分析

2.1 羟脯氨酸标准曲线的绘制

测定标准曲线，如图1所示。

计算其回归方程为：

A=0.054*C+0.083

A——吸光度；C——羟脯氨酸浓度ug/mL；相关系数R=0.996

2.2 微波辅助水解鱼鳞条件的优化

单因素试验表明，微波时间、微波功率和盐酸浓度对羟脯氨酸浓度均有影响。因此，通过L9（34）正交试验，进一步研究它们的影响。正交试验结果见表1。

由表1分析，可以看出微波辅助水解鱼鳞测定羟脯氨酸的最佳工艺组合是A2B2C3和A2B1C3。A因素微波时间和C因素盐酸浓度的Sig值小于0.05，对实验结果有显著影响，B因素微波功率对试验结果影响不显著。通过验证试验A2B2C3的Hyp浓度为12.527，A2B1C3的Hyp浓度12.316，所以最佳水解条件组合为A2B2C3。