丁蒙蒙 时小东 顾雨熹 代娇 盛玉珍 徐莺 庄国庆

摘 要：  楠木（Phoebe zhennan）為樟科常绿乔木，是国家二级重点保护树种。楠木生长缓慢，木材形成所需周期较长，其原因有待进一步深入分析。近年来转录因子已成为植物分子生物学研究的热点，高通量测序技术的应用和发展促进了转录因子的挖掘和深入分析。该研究基于我国特有濒危树种楠木的转录组数据，通过与拟南芥基因组MYB转录因子进行对比，对楠木MYB转录因子进行挖掘和生物信息学分析，并结合功能预测和不同组织表达对其进行深入分析。结果表明：从楠木转录组数据中，共挖掘出82个MYB转录因子，这82个MYB转录因子蛋白质所含氨基酸数目为50～1 121个、分子量为5.907～123.64 kDa，整体表现为亲水性不稳定蛋白，以α-螺旋和无规则卷曲为主要二级结构元件。序列比对和进化树分析表明，楠木MYB转录因子的结构域有高度保守性，含有[W]-X（19）-[W]-X（19）结构; 82个PzMYB可分为22类，参与生长发育、次生代谢、逆境响应等过程，与功能预测分析结果相一致。同时，在楠木茎和叶中，差异表达PzMYB数目为18个，其中上调10个、下调8个。该研究结果不仅对楠木MYB转录因子的挖掘和功能分析以及分子生物学研究奠定了基础，而且还对其遗传改良和分子育种具有参考价值。

关键词： 楠木， 转录组， MYB转录因子， 生物信息学， 基因表达

中图分类号：  Q943.2， S792.24

文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2018）01-0090-11

Transcriptome-based excavation and analysis of MYB family transcription factors in Phoebe zhennan

DING Mengmeng1， SHI Xiaodong1， GU Yuxi1， DAI Jiao1， SHENG Yuzhen2， XU Ying1， ZHUANG Guoqing2*

（ 1. Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment of Ministry of Education， College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610064， China; 2. Sichuan Academy of Forestry， Chengdu 610081， China ）

Abstract：  Phoebe zhennan is an endemic valuable tree to China and listed as one of the national second-class protected wild plants. The growth rate of P. zhennan is too slow and the operating cycle is too long. To date， there is no reason to explain this phenomenon. These years have witnessed transcription factors becoming a focus on the researches about plants molecular biology， as the high-throughput sequencing technology has been well applied and developed. In the present study， the identification and phylogenetic analysis of the P. zhennan MYB （PzMYB） transcription factor family was performed and the expression profiles of these genes were determined. PzMYBs were identified from the P. zhennan transcriptome using bioinformatics tools， and their putative functions were determined based on the phylogenetic tree and classified into subfamilies using AtMYBs describing known functions. The results showed that 82 PzMYB transcription factors were excavated， and they encoded 50-1 121 amino acids， predicting hydrophilic and unstable. Their main structural elements were α-helix and irregular curl. Also， the sequence analysis and construction of phylogenetic tree showed that these MYB transcription factors had a certain conserved type， containing  [W]-X（19）-[W]-X（19）. Eighty-two PzMYB could be divided into 22 categories， and were related to the plant response to biotic stresses， cell development， secondary metabolism etc. Their involvements in response to stresses were reported by several transcriptional studies， which was precisely consistent with the functional prediction. Lastly， the members in the same subfamily had different spatial and temporal expression profiles， with genes in stems and leaves expressed at various levels， which was precisely consistent with the functional prediction. In stem， the numbers of differential expression of genes were eighteen， ten up-regulated and eight down-regulated in leaf. Based on the transcriptome data of P. zhennan， an endemic tree in China， we excavated and analyzed its MYB transcription factors， and provided valuable information for PzMYB gene cloning and functional characterization of P. zhennan. This research will lay a foundation for the study of molecular biology of P. zhennan and provide references for its genetic modification and molecular breeding.

Key words： Phoebe zhennan， transcriptome， MYB transcription factors， bioinformatics， gene expression

转录因子又称反式作用因子，是指与基因启动子顺式作用原件发生相互作用，能调控基因转录的一类蛋白质。其特点为普遍含有寡聚化位点区、DNA结合区、核定位信号区和转录调控区4个功能结构域（Liang et al，2005）。植物分子遗传学的研究表明，转录因子在植物生长发育，生理代谢，病原菌防御，细胞形态及模式建成等一系列生理过程以及对外界环境的反应中起重要作用（Dubos et al，2010）。因此，利用转录因子对植物进行各方面的调控具有良好前景。植物的次生生长对植物自身机体机械支持、水分运输、抗逆，以及人类的生产活动具有重要意义（田敏等，2007）。在众多的转录因子家族中，NAC、WRKY、ERF、MYB等均参与植物的次生生长的代谢调控（陈莹等，2009）。Mitsuda et al（2005）發现在拟南芥中，NST1（NAC secondary wall thickening promoting factor1，NST1）和NST2主要参与对花药细胞次生壁增厚的调控，过表达的NST1的转基因拟南芥中某些木质素生物合成基因的表达增强。WRKY是通过结合植物次生代谢生物合成途径关键酶基因的启动子元件进而来调节代谢过程（Kakeshpour et al，2015）。MYB类转录因子则是参与植物苯丙烷类次生代谢途径的调节（Geethalakshmi et al，2015）。在木质素生物合成关键酶的编码基因的启动子上已经发现与转录调节相关的AC元件，AC元件多存在于苯丙烷途径基因的启动子区，一些MYB类转录因子可结合于此，从而参与木质素生物合成，在次生细胞壁形成中具有重要的调控作用（Li et al，2015）。

MYB转录因子是最大的植物转录因子基因家族之一，其共同特征是在其N端有一段51～52个氨基酸组成的MYB结构域，各个MYB重复片段编码三个α-螺旋，其中第二个和第三个的α-螺旋折叠为螺旋-转角-螺旋结构，可在特异识别位点与DNA的大沟结合（Hai et al，2012）。根据MYB结构域重复个数（R）将MYB转录因子分为4类。MYB转录因子主要参与植物细胞周期、细胞分化、逆境胁迫应答、次生生长代谢以及叶片等器官的形态建成等生物学过程（Li et al，2014）。目前，MYB转录因子已在拟南芥、金鱼草、大豆、烟草、苹果、白桦、白杨等物种中分离并鉴定出来（Cao et al，2016）。Du et al（2012）对157个玉米MYB转录因子和125个拟南芥MYB转录因子进行分析，结果表明有4个亚组的MYB转录因子与木质素合成以及次生壁增厚有关。其中拟南芥AtMYB26的异源过表达促使木质部增厚。刘慧子等（2016）从白桦MYB家族中鉴定了17条MYB家族基因，研究表明，绝大部分的MYB基因与形成层发育，木质部形成相关。叶胜龙（2015）对毛白杨MYB055转录因子在次生壁合成中的调控机制进行研究，通过对转基因植株的测定，结果发现MYB055的过量表达可使木质部在茎中的异位沉积，提高毛白杨中木质素的含量。对转MYB055基因植株中关键酶基因的表达量分析得知，不仅苯丙氨酸代谢途径上基本的关键酶基因表达量有所上升，而且与木质素合成途径特异相关的关键酶基因、纤维素合成相关基因、木聚糖合成相关基因的表达量也都有所上升。上述研究表明，植物中MYB转录因子可以参与木质素合成调控网络进而调节植物木质部形成，从而调节植物发育和木材形成。

楠木，又名桢楠，为樟科常绿乔木，是国家二级重点保护树种，也是我国的特产树种（张炜等，2012）。其自然分布较少，现主要分布在贵州东北部，四川盆地西部的阔叶林中，在园林中，常作为庭荫树或行道树。近年来，关于楠木的研究报道，多集中在楠木的育苗与栽培、病虫害防治、人工林生长规律等的研究（杜娟和卢昌泰，2009）。这些研究结果表明，楠木生长缓慢，木材形成所需周期较长，其原因有待进一步深入分析。因此，本研究从楠木转录组数据入手，结合楠木不同组织高通量测序数据，对MYB转录因子挖掘，并对其表达进行分析，为楠木木材形成及发育研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

楠木种子采自四川省峨眉山，种植于四川省林业科学研究院基地。本研究分别取茎和叶为材料，迅速置于液氮中。将材料送北京百迈客生物科技有限公司，提取RNA后，构建测序文库，利用Illumina HiSeqTM 2000 平台进行测序，每个组织重复2次。对原始测序数据进行过滤后采用Trinity（http：//trinityrnaseq.sourceforge.net/）软件对经过滤的高质量数据进行组装获得unigene序列。

1.2 方法

1.2.1 PzMYB序列鉴定与理化性质分析 从拟南芥转录因子数据库Planttfdb（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）下载转录因子序列，并以此作为参考序列进行对比;从Pfam数据库（http：//pfam.xfam.org/）下载MYB家族保守序列（PF00249），对转录组数据进行注释，并剔除假阳性序列。利用ExPaSy（http：// expasy.org/）对PzMYB编码的氨基酸进行一二级结构分析。利用ProtComp （http：//linux1.softberry.com/all.htm）、SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/）对PzMYB编码蛋白的亚细胞定位、信号肽进行分析。

1.2.2 PzMYB序列保守结构域及进化树分析 利用DNAMAN 5.0对PzMYB进行多序列比对;利用在线软件MEME数据库（http： //meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi）对PzMYB进行保守序列预测。利用从Planttfdb数据库下载的拟南芥MYB转录因子作为参考序列，运用MEGA 5.0软件构建邻接树，构建方法为Neighbor-Joining，Bootstrap 重复1 000次。

1.2.3 PzMYB序列的功能分析 运用BlastX将含有PzMYB核苷酸序列对比到Non-redundant protein sequence database（Nr）、Nucleotide sequence database（Nt）、Gene Ontology database（GO）和The database of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库中，对比参数为e<10-10，预测生物学功能。

1.2.4 PzMYB的表达模式分析 基于转录组数据，利用定量软件RSEM进行表达量水平评估，并利用FRKM值表示对应Unigene的表达丰度。使用EBSeq进行差异表达分析，获得两个样品之间的差异表达基因集（FDR<0.01;Fold Change≥2）。将数据均一化后，使用R语言gplots程序包绘制热图。

2 结果与分析

2.1 楠木转录因子的挖掘及生物信息学分析

基于楠木转录组数据，与拟南芥转录因子进行对比分析，共对比出转录因子2 275个，涉及53种（表1）。其中，WRKY转录因子家族是数量最多的一类，共鉴定出489个，其次为NAC和MYB转录因子家族，数量分别为374和147个。本研究主要对MYB转录因子家族进行分析，对初步得到的147个MYB转录因子进一步分析，利用Pfam的MYB模型（PF00249）进一步对比筛选，并于NCBI Conserved Domains对比，手动去除冗余及不完整编码序列等，共鉴定获得82个序列含有MYB结构。通过系列分析，从楠木转录组数据中共鉴定出MYB家族序列82条。

82个PzMYB蛋白质的氨基酸数目在50～1 121之间，对应分子量为5.908～123.636 kDa;其中有49个蛋白的理论等电点大于7，有33个小于7;pI最小值为4.68（PzMYB43），最大值为10.44（PzMYB69），所有蛋白的理論等电点平均值为7.76。从不稳定系数来看，有10个蛋白的不稳定系数小于40（稳定蛋白），其他72个大于40（不稳定蛋白），说明楠木MYB转录因子家族整体是不稳定蛋白。由脂肪系数可知，81个PzMYB蛋白质小于100，为亲水性蛋白;只有1个大于100（PzMYB80）。SOPMA分析表明，PzMYB蛋白质二级结构均含有α-螺旋、β-转角、扩展链和无规则卷曲结构。其中，23个以α-螺旋为主要构成元件，以无规则卷曲构成次要元件;59个以无规则卷曲为主要构成元件，以α-螺旋构成次要元件;β-转角和扩展链所占百分比少。

ProtComp分析表明，82个PzMYB蛋白质中共有67个（81.71%）定位在细胞核中;其余15个MYB成员定位在细胞质中，可能参与细胞质基因的转录调控。采用SignalP对信号肽进行预测，82个PzMYB蛋白质中，7个存在信号肽（PzMYB78、PzMYB4、PzMYB12、PzMYB13、PzMYB21、PzMYB27、PzMYB33），为分泌蛋白。信号肽位于分泌蛋白的N端，由15～30个氨基酸组成，在蛋白质定位和蛋白移位中起着重要作用;其它PzMYB蛋白则不存在信号肽，这些蛋白可能在细胞质中合成，不进行蛋白质转运。

2.2 PzMYB基因家族的结构分析

利用DNAMAN和MEME对PzMYB蛋白进行结构域对比分析和保守图绘制（图1，图2）。对于42个R1型MYB序列，其保守结构域氨基酸数目为21～48个，R1保守基序类型为[W]-X（19）-[W]-X（19）-[W]，含有3个高度保守的色氨酸残基（W），色氨酸残基间隔19个氨基酸残基序列。此外，含有相对保守的谷氨酸（E），甘氨酸（G），精氨酸（R）残基。对39个R2R3型PzMYB进行对比分析，得到含有60个氨基酸残基的R2结构域和含有39个氨基酸残基的R3结构域。R2结构与R1结构相似，也含有3个色氨酸残基，且色氨酸残基间隔19个氨基酸残基。对于R1和R2，替代第一个色氨酸残基的通常为苯丙氨酸（F）和亮氨酸（L）。同时，R2含有相对保守氨基酸残基序列半胱氨酸（C）甘氨酸（G）赖氨酸（K）丝氨酸（S）半胱氨酸（C）精氨酸（R）亮氨酸（L）精氨酸（R），以及甘氨酸（G），谷氨酸（E），精氨酸（R）等保守氨基酸残基。与R1和R2不同，PzMYB中R3保守结构域含有2个色氨酸残基，均表现为高度保守，均未发生替换现象;此外含有多个高度保守氨基酸残基，如亮氨酸（L），谷氨酸（E），甘氨酸（G），精氨酸（R）等。上述结果表明，PzMYB结构域具有高度保守性，除了含有色氨酸残基外，还含有其他保守氨基酸残基和序列，这样的结构可以更好的维持PzMYB的螺旋转角螺旋结构，从而与DNA分子进行结合而发挥功能。

2.3 PzMYB系统进化树分析

植物中的MYB转录因子数量众多，基因功能种类繁多，且在拟南芥中研究较为透彻。为了比较系统的研究PzMYB蛋白家族的进化关系并预测其功能，采用MEGA5.10软件构建PzMYB和AtMYB进化树（图3）。基于拟南芥MYB转录因子划分的25个亚家族（S1-S25），对PzMYB家族进行系统进化树构建，由图3可知，在S9、S10、S25这3个亚家族中未发现PzMYB家族蛋白，其余22个亚家族中均有PzMYB分布。基于拟南芥中的研究，PzMYB可主要分为以下几类。

植物次生代谢方面，MYB转录因子在基因水平上研究最清楚的是黄酮类化合物的生物代谢途径，它是苯丙烷类代谢途径中的一个重要分支，主要参与黄酮类化合物的合成（李军等，2016）。在拟南芥中，S4、S5、S6、S7亚家族参与花青素和黄酮类化合物合成途径（Li et al，2016）。该亚家族中，涉及PzMYB48、PzMYB5、PzMYB34、PzMYB18、PzMYB50、PzMYB76和PzMYB31，其可能参与花青素和黄酮类化合物的合成。楠木的PzMYB22具有类似的功能，可能具有调控单宁酸的过程。

植物生长发育方面，AtMYB58、AtMYB63、AtMYB72在拟南芥纤维和导管中激活木质素的生物合成（Tak et al，2017）;AtMYB52、AtMYB54、AtMYB69、 AtMYB0/1能够促进纤维细胞中细胞壁的增厚（Omer et al，2013）。由此推测楠木PzMYB12、PzMYB15、PzMYB9、PzMYB16、PzMYB46、PzMYB41、PzMYB69、PzMYB71、PzMYB49、PzMYB53可能参与木质素的生物合成及细胞壁的增厚等次生生长过程。在拟南芥中，S15亚家族、S21亚家族、S3亚家族和S8亚家族参与木质素的生物合成、次生细胞壁合成的调控网络（Guo et al，2017）。基于此，PzMYB17、PzMYB14可能参与毛状体的生成;PzMYB40、PzMYB32、PzMYB38、PzMYB4可能参与调控叶腋分生组织的表达。

植物抗逆性方面，拟南芥S18亚家族，S3亚家族，S22亚家族和S1亚家族参与非生物胁迫（Aoyagi et al，2014）（如高温和干旱）和生物胁迫（如细菌、霉菌）（Zhang et al，2011）。通过聚类分析，在PzMYB中有16个与抗逆相关的AtMYB亚家族聚集在一起，涉及PzMYB77，PzMYB82，PzMYB70和PzMYB73等，说明PzMYB转录因子可能参与楠木的胁迫响应等生理过程。

2.4 PzMYB功能预测

利用BLAST软件将含有PzMYB序列与Nr、Nt、GO和KEGG数据库进行对比，获得注释文件。结果表明，82条PzMYB序列均得到注释。在Nr数据库和KOG数据库中82条序列均得到注释;其次是在GO数据库中，注释条数为69条。KEGG数据库注释数量为49条。GO分类注释表明，注释序列涉及23个GO分类。其中，注释到分子功能（Molecular Function）、细胞组分（Cellular Component）和生物学过程（Biological Process）分类号分别为51、20、52个。在分子功能类中，主要与结合活性有关，注释最多的GO分类为binding;在细胞进程和生物学进程类中，主要以cellular component和response to stimulus居多。综合可知，PzMYB主要作为转录因子发挥作用，其通過结合到DNA区域发挥相应的调控功能，主要涉及植物的生物体生长发育和物质代谢等过程。

2.5 PzMYB表达分析

从楠木高通量转录组测序数据库中提取茎和叶的转录组数据，得出PzMYB家族转录因子在组织中的表达量，并绘制热图（图5）。图5结果表明，PzMYB在组织表达模式上存在差异，大多数成员在茎和叶组织中均有表达，表达模式呈现多样化。其中，在叶中表达的PzMYB有61个，在茎中表达的有70个。有8个PzMYB家族成员在叶组织中有表达，而在茎中不表达;有17个在茎组织中有表达，而在叶中不表达。对茎叶中都表达的PzMYB进行差异分析，结果表明在茎叶中差异表达PzMYB共18个，上调表达10个，下调表达8个（以叶片为对照组，茎为实验组）。其中，在茎中PzMYB4、PzMYB17、PzMYB26和PzMYB78的表达量高，而在叶组织中表达呈下调;而PzMYB6、PzMYB65、PzMYB67和PzMYB72 PzMYB80、PzMYB58、PzMYB73和PzMYB63在叶片中表达量呈现上调。根据表达模式推测，PzMYB4、PzMYB17、PzMYB26和PzMYB78可能参与楠木茎的次生生长和木质素合成等途径;PzMYB31、PzMYB76可能参与楠木叶片的次级代谢、产物代谢和物质合成等途径，这也与功能预测相一致。后续可通过对PzMYB基因进行克隆，并转化模式植物等深入分析，进一步验证挖掘的PzMYB功能。

3 讨论与结论

由于木本植物杂合性强，基因组数据相对较大和复杂，很难在短时间内获得其全基因组数据信息，这严重制约了木本植物的相关研究（江香梅等，2014）。但是随着高通量测序技术的发展，使得转录组测序技术更加准确和快速。尽管与全基因组测序相比，转录组测序具有一定的局限性，但是作为一种高效的方法广泛应用于植物研究，尤其是非模式植物。对于没有参考基因组的木本植物，可以先采用转录组测序等高通量测序技术构建相应的数据库信息，从而提供相应的遗传背景信息。本研究采用Illumina HiSeq2000平台对楠木茎叶组织进行转录组测序，得到了丰富的基因信息和高质量的拼接序列，为楠木及其近缘植物的生物学研究提供了有利的数据支持。同时，基于相关基因的分析，也为其问题解决和后续研究开展提供了参考和支持。

MYB基因家族是一类在植物生长发育过程中起重要作用的转录因子。在植物中，第一个MYB基因ZmMYBC1从玉米中克隆得到（马婧等，2009），现已从拟南芥、金鱼草、大豆、烟草、苹果、白桦、白杨、梨等植物中已经克隆上千个MYB家族序列（张丽等，2013），这为其他物种MYB基因家族的挖掘和分析提供了有利条件。本文正是基于前人的研究，利用课题组构建的楠木转录组数据库，运用生物信息学手段，对MYB家族进行分析，共鉴定出MYB家族基因82个，氨基酸数目在50～1 121之间，可能是由于可变剪切导致了不同基因编码区和非编码区在基因全长的比例呈现多态性（谢腾等，2014）。二级结构预测表明，其主要元件为α-螺旋和无规则卷曲等;81.71%的PzMYB定位在细胞核中，这说明大部分PzMYB可能与靶基因的DNA结合区域结合而发挥作用。同时对保守结构域进行分析，PzMYB基因家族具有高度保守性，含有两个高度保守的色氨酸残基以及氨基酸残基间隔数目，第一个色氨酸残基位置可被苯丙氨酸替代，这与其他报道结果相一致（Zhao et al，2014）

作为一种重要的模式植物，拟南芥中MYB家族基因功能研究较为清晰。对PzMYB与AtMYB进行同源进化树构建，研究PzMYB与拟南芥的进化关系，从而对PzMYB进行功能的预测，为后续的功能验证提供参考。基于同源性分析，与拟南芥S4-S7亚家族聚类的PzMYB48、PzMYB5、PzMYB34等7个PzMYB可能参与到花青素与类黄酮等物质合成途径中相关基因的转录调控。如PzMYB31可能转录激活类黄酮生物合成途径中的CHS，CHI和FLS等上游基因，PzMYB18、PzMYB50可能与AtMYB75、AtMYB90功能类似，与bHLH等形成复合体，从而转录调控ANS等花青素合成途径中的下游基因。同时，研究表明MYB家族与植物纤维素和木质素等植物次生细胞壁合成的关键调节因子，如过表达AtMYB46和AtMYB83通过调控上述物质合成，导致次生细胞壁沉积（Zhou et al，2009）。由此推测，楠木中PzMYB12、PzMYB15、PzMYB9等10个可能参与楠木次生细胞壁的生成。楠木作为我国二级濒危植物，其生长缓慢，60 a才能进入快速生长期，从而严重制约了楠木的发展和大面积种植，如果能够运用分子生物学的方法对其品种进行改良和筛选，从而加速其生长和次生物质积累，将具有重要的意义。

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