谭德超 罗花 邓家刚 郝二伟 易湘茜 冯小慧 韦林垚 夏中尚 徐炜杰 谢金玲 侯小涛

摘 要：該研究采用超声提取法，得到红海榄的叶、秋茄的茎和叶、水黄皮的叶和桐花树的茎的95%乙醇提取物，并用MTS法检测提取物对前列腺癌DU145、PC3细胞增殖抑制效果，结果桐花树茎95%乙醇提取物对DU145细胞增殖抑制作用最强，对DU145干预24、48、72 h的IC50分别为75.23、88.81、76.53 μg·mL-1。在此基础上，依次采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对桐花树茎95%乙醇提取物进行梯度萃取，得到不同极性部位后选择桐花树茎乙酸乙酯部位（EACS）对19种肿瘤细胞（HT-29，SW480，DLD-1，COLO205，PC3，DU145，SKOV3-S，A2780，SGC-7901，Tca-8113，MDA-MB-231，HepG2，SMMC-7721，Bel-7402，MHCC-97H，Hela，PANC-1，EJ，A549）和3种正常细胞（HUVEC，EC304，RWPE-1）进行MTS实验检测其抗增殖作用，用集落形成进一步检测EACS对细胞HT-29、DLD-1、SW480、DU145、PC3、SKOV3-S的增殖影响。结果表明：EACS对16个肿瘤细胞和3个正常细胞均具有不同程度的增殖抑制作用，其中对RWPE-1的增殖抑制作用最强，药物作用72 h后的IC50为22.78 μg·mL-1;EACS对细胞HT-29、DLD-1、SW480、DU145、PC3、SKOV3-S的集落形成均具有抑制作用，抑制作用强度与浓度成正相关关系。

关键词：红树植物，抗肿瘤活性，筛选，MTS，集落形成

中图分类号：R932

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2018）10-1267-10

Abstract：Ninety-five percent of  ethanol extracts from the leaves of Rhizophora stylosa，stems and leaves of Kandelia candel，leaves of Pongamia pinnata and stems of Aegiceras corniculatum were extracted by ultrasonic extraction method. The cytotoxicity of 95% ethanol extracts from these four mangrove plants on prostate cancer cells DU145 with 24，48 and 72 h and PC3 were tested by MTS assay. The results showed that the anti-proliferation on prostate cancer cell DU145 of 95% ethanol extract of A. corniculatum stems was the strongest among the tested samples with IC50 value of 75.23，88.81 and 76.53 μg·mL-1 to DU145，respectively. On this basis，the ethanol extract of A. corniculatum stems was successively treated with petroleum ether，ethyl acetate and n-butanol to yield four fractions ，then the ethyl acetate fraction of A. corniculatum stems（EACS） were tested for anticancer activities against nineteen tumor cells（HT-29，SW480，DLD-1，COLO205，PC3，DU145，SKOV3-S，A2780，SGC-7901，Tca-8113，MDA-MB-231，HepG2，SMMC-7721，Bel-7402，MHCC-97H，Hela，PANC-1，EJ，A549） and antiproliferative effects of three normal cells（HUVEC，EC304，RWPE-1） by MTS assay，the effects of EACS on proliferation of HT-29，DLD-1，SW480，DU145，PC3 and SKOV3-S cells were detected by the colony formation assay. The results showed that EACS exhibited different degrees of inhibitory effect on proliferation of sixteen tumor cells and three normal cells，and had the stronger inhibitory effect on the proliferation of RWPE-1 with IC50 value of 22.78 μg·mL-1 after 72 h drug treatment. EACS inhibited the colony formations of HT-29，DLD-1，SW480，DU145，PC3 and SKOV3-S cells in a dose-dependent manner.

Key words：mangrove plants，antitumor activity，screening，MTS，colony formation

肿瘤是目前世界上发病率及致死率高的疾病之一。2012年全球肿瘤新增病例约有1 410万，死亡病例有820万;欠发展国家的新增病例占57%，死亡病例占65%（Torre et al，2015）。中国2015年的癌症新发病例达429万，死亡病例281万（Chen et al，2016）;中国癌症发病占全球癌症发病的21.8%，癌症死亡占全球的26.9%，发病率处于世界癌症平均发病水平，但死亡率相对较高（高婷等，2016）。目前临床上治疗肿瘤的药物种类及数量较多，但多数药物均具有恶心、呕吐等毒副作用从而限制了其使用范围。因此，寻找有效低毒的新型抗肿瘤药物是极为迫切的。

药物的传统来源是陆生植物或微生物的天然产物，尤其是次生代谢产物，如阿司匹林、青霉素、吗啡的发现。在肿瘤领域的临床用药至少60%是天然药物来源（Das et al，2015），如多柔比星、紫杉醇。相对陆生植物资源的药用研究，海洋生态系统相当于药用研究领域的新大陆，且与陆地生态系统差异显著，有望从丰富的资源中分离出化学结构多样的活性成分（Molinski et al，2009）。红树植物生长于热带和亚热带沿海潮间带（Mercer & Hamilton，1984），是海洋生态系统的重要组成部分。高盐、高温、潮湿、强风等潮间带环境，迫使红树植物通过合成新颖的次生代谢产物来保护自身（Scholander et al，1962;Zhang et al，2007）。环境的特殊性使红树植物相对于其他陆生植物更易产生一些结构新颖的生物活性成分，从中找到新药先导化合物的可能性极大。此外，红树植物在传统医学中应用广泛，可用于治疗肿瘤、糖尿病、麻风病、眼病、肝炎等病症（Bandaranayake，1998）。基于生理特异性和传统医学应用，红树植物是值得应用现代医药技术进行深入研究的。

现代研究表明红树植物中的主要化合物有脂肪族醇、氨基酸、多不饱和脂肪酸、萜类、黄酮类、生物碱类、醌类、木脂素类、甾醇类、鞣质、杂环化合物等，并具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗高血压、抗炎、抗氧化、虫鱼毒性等生物活性（Bandaranayake，2002;Patra & Thatoi，2011;杨维等，2011）。近年来，红树植物的抗肿瘤研究证明其具有广泛的抗肿瘤活性，并从中分离出众多具有抗肿瘤活性的成分（Das et al，2015），如桐花树果甲醇提取物对VERO、NIH3T3、AGS、HT-29、MCF-7、MDA-MB-231具有较强的细胞毒性，IC50在0.000 5～0.998 mg·mL-1之间（Akter et al，2014）。从桐花树中分离出具有抗肿瘤活性的aegicoroside A、sakurasosaponin、sakurasos-aponin methyl ester（Vinh et al，2017）、5-氧-乙基信筒子醌、5-氧-甲基信筒子醌（徐岷涓等，2008）和Embelin及其洐生物（Thota et al，2016;李勇，2010）。此外，还从木果楝（Xylocarpus granatum）中分离出具有抗肿瘤活性的xylogranatin A、xylogranatin B、xylogranatin C、xylogranatin D（Yin et al，2006）等。但据文献报道，目前对于桐花树抗肿瘤作用的系统研究偏少，对其抗肿瘤作用的机理及活性成分研究仍有待深入。总的来说，红树植物仍是一类资源丰富但药物开发研究相对较少的物种（Kathiresan et al，2006;Harshad，2016）。应当在现有的研究基础上开展更深入的研究，以期从中分离出更多具有生物活性的天然化合物及开发出优于当前临床治疗肿瘤的药物。本研究对广西沿海的四种红树植物进行细胞毒性检测来评价它们对前列腺癌细胞DU145、PC3的增殖抑制作用，并进一步选择作用较强的桐花树进行体外抗肿瘤活性评价。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂、耗材和仪器

四种红树植物：红海榄（109°40′03.3″ E，21°32′11.8″ N）、水黄皮（109°39′58.4″ E，21°32′04.9″ N）、秋茄（109°40′05.2″ E，21°32′14.3″ N），2016年7月采自广西北海市合浦县山口国家级红树林生态自然保护区;桐花树（108°03′49.7″ E ，21°32′06.7″ N），2016年7月采自广西防城港市北仑河口红树林保护区。由广西中医药大学韦松基教授分别鉴定为红海榄（Rhizophora stylosa）的成熟叶及嫩叶，水黄皮（Pongamia pinnata）的成熟叶及嫩叶，秋茄（Kandelia candel）的茎和叶（成熟叶及嫩叶），桐花树（Aegiceras corniculatum）的茎。干燥标本保存于广西中医药大学中药药效研究重点研究室中。

细胞系：人结直肠癌细胞 HT-29，SW480，DLD-1，COLO205; 人前列腺癌细胞 PC3，DU145; 人卵巢癌细胞 SKOV3-S，A2780; 人胃癌细胞 SGC-7901; 人舌癌细胞 Tca-8113;人乳腺癌细胞MDA-MB-231; 人肝癌细胞 HepG2，SMMC-7721，Bel-7402，MHCC-97H; 人宫颈癌细胞 Hela; 人胰腺癌细胞 PANC-1; 人膀胱癌细胞 EJ; 人非小细胞肺癌细胞 A549; 人脐静脉内皮细胞 HUVEC; 人血管内皮细胞 EC304; 人正常前列腺上皮细胞 RWPE-1。

试剂：95%乙醇（批号为2016070601，厂家为成都科龙化工试剂厂）、乙酸乙酯（批号为2016090601，厂家为成都科龙化工试剂厂）、正丁醇（批号为2016092201，厂家为成都科龙化工试剂厂）、石油醚（批号为2016060101，厂家为成都科龙化工试剂厂）、水溶性甲臢盐 MTS（批号为219904，厂家为Promega）、培养基RPMI 1640（批号为350006026，厂家为WISENT）、DMEM（批号为20170315，厂家为江苏凯基）、 L15（批号为161109，厂家为江苏凯基）、 McCoYs 5A（批號为20170407，厂家为江苏凯基）、 MEM（批号为161227，厂家为江苏凯基）、F12K（批号为319085020，厂家为WISENT）、胎牛血清 FBS（批号为1739463，厂家为Gibco）、青霉素/链霉素双抗溶液（批号为1864844，厂家为Gibco）、胰酶0.25% Trypsin-EDTA（批号为1859509，厂家为Gibco）、平衡盐溶液D-PBS（批号为311425016，厂家为WISENT），DMSO（批号为1029B033，厂家为Solarbio）。

耗材：96孔板（批号为3599，厂家为Corning）、5 mL移液管（批号为4487，厂家为Corning）、10 mL移液管（批号为4488，厂家为Corning）、15 mL离心管（批号为430791，厂家为Corning）、50 mL离心管（批号为430829，厂家为Corning）。

仪器：显微镜（型号为ECLIPSE TS100-F，厂家为Nikon）、生物安全柜（型号为1389，厂家为Thermo）、酶标仪（型号为Multiskan，厂家为Thermo）、扫描仪（型号为9000F，厂家为Canon）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞分别接种在含有10% 胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素的相应培养基中，于37 ℃，5% CO2恒温孵箱中培养。不完全培养基及相应的细胞系依次为RPMI 1640（PC3，DU145，Bel-7402，DLD-1，EJ，SGC-7901，SMMC-7721，Tca-8113，COLO205，EC304）、DMEM（A2780，PANC-1，HUVEC，MHCC-97H）、L15（MDA-MB-231，SW480）、McCoYs 5A（HT-29，SKOV3-S）、MEM（HepG2，Hela）、Keratinocyte-SFM（RWPE）和F12K（A549）。

1.2.2 样品的制备 将红树植物晒干，分拣茎、叶，粉碎后分别用95%乙醇超声提取1 h，滤过后用冷冻真空旋转蒸发仪回收乙醇（低于60 ℃），浓缩至无醇味，60 ℃水浴干燥即得95%乙醇提取物。桐花树茎的95%乙醇提取液在浓缩至无醇味后，依次进行石油醚、乙酸乙酯、正丁醇的萃取，萃取物浓缩干燥得桐花树茎不同极性部位。取以上的95%乙醇提取物和桐花树茎乙酸乙酯部位（EACS）进行肿瘤细胞的细胞毒性筛选。将提取物溶解于DMSO中，配成100 mg·mL-1的储备液，提取物不易溶解时，置于超声仪超声溶解，并用0.22 μm微孔滤膜过滤后分装于EP管，保存于-20 ℃。

1.2.3 体外肿瘤细胞增殖抑制实验（MTS法） 将对数生长期的细胞种植在96孔板中，每孔2 000个细胞，每组设置3个复孔，置于37 ℃，5% CO2恒温孵箱中过夜贴壁后给药。95%乙醇提取物给药梯度各不同，EACS设5个给药梯度组（50.0、75.0、100.0、150.0、200 μg·mL-1），每组给药组分别设置相应的药物颜色扣除孔，以及培养液对照组、DMSO对照组，设置3块板，分别进行24、48、72 h的检测。给药后置于37 ℃，5% CO2恒温孵箱中进行常规培养。分别在培养24、48、72 h后，每孔加入20 μL完全融化后的Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent，将细胞放回培养箱中继续培养2 h，于酶标仪上在490 nm波光处读取吸光度值。细胞活力=药物干预组/对照组×100%。用GraphPad Prism 5作折线图，用SPSS 21计算IC50。

1.2.4 集落形成实验 将细胞以每个孔400个的密度均匀地铺于6孔板中，24 h之后给予药物EACS（12.5、25 μg·mL-1）干预，并设置对照组。4 d后换一次液，新的液体分别为完全培养基、相同浓度的药物组，8 d后终止克隆形成。将6孔板从培养箱中取出并吸走液体，用D-PBS缓冲液清洗两遍后用4%的多聚甲醛固定20 min，吸走4%多聚甲醛后用结晶紫染色液染色18 min。吸走结晶紫并用D-PBS清洗干净，将6孔板用扫描仪扫描。克隆形成率=克隆形成数/种板细胞数×100%。

2 结果与分析

2.1 四种广西沿海红树植物对人前列腺癌细胞DU145、PC3的抑制作用

细胞增殖实验表明，除了红海榄，秋茄、桐花树、水黄皮的95%乙醇提取物对人前列腺癌DU145、PC3增殖均表现出一定的抑制作用，且抑制作用随着药物浓度的增加而增强，呈量效关系。秋茄茎95%乙醇提取物对DU145、PC3细胞增殖抑制效果在作用了72 h时最强，IC50分别为81.48、97.77 μg·mL-1;秋茄叶95%乙醇提取物抑制DU145、PC3细胞的增殖也是在72 h时最强，IC50分别为93.21、59.75 μg·mL-1。桐花树茎95%乙醇提取物对DU145细胞增殖抑制作用在24 h时最强，IC50为75.23 μg·mL-1;而对PC3细胞增殖抑制作用则是在48 h时最强，IC50为97.13 μg·mL-1。水黄皮叶95%乙醇提取物对DU145、PC3细胞增殖抑制作用均在72 h时最强，IC50分别为170.57、184.82 μg·mL-1。結果见图1和表1。

在药物干预了48、72 h时，均是桐花树茎95%乙醇提取物对DU145细胞增殖抑制作用的IC50最小，表明其对DU145细胞增殖抑制作用最强。

2.2 EACS对19种人肿瘤细胞和3种人正常细胞的抑制作用

EACS对19种人肿瘤细胞和3种人正常细胞中的细胞增殖实验结果表明，EACS在药液浓度50～200 μg·mL-1的范围内对人肝癌细胞MHCC-97H、SMMC-7721和人非小细胞肺癌细胞A549无明显细胞毒性，而对其他16种肿瘤细胞和3个正常细胞均具有不同程度的增殖抑制效果，抑制作用随着浓度的增加而增强，呈量效关系。结果见图2和表2。

以药物作用48和72 h的IC50为参照，在16个肿瘤细胞中，EACS对结直肠癌COLO205细胞增殖抑制作用最强，IC50分别为83.51、117.03 μg·mL-1;其次是结直肠癌DLD-1细胞，细胞增殖抑制作用的IC50分别为142.45、146.28 μg·mL-1。EACS对3个正常细胞的增殖也具有抑制作用，对HUVEC、EC304、RWPE-1细胞增殖抑制作用依次增强;在EACS干预48、72 h时，RWPE-1细胞增殖抑制作用的IC50分别为87.64、22.78 μg·mL-1。由此可见，EACS对细胞增殖抑制作用不具有选择特异性，不能区分肿瘤细胞与正常细胞。若进一步对EACS进行分离，得到的细胞增殖抑制作用活性成分，可考虑化学结构修饰，以期从中得到具有选择特异性的抗肿瘤活性成分。

EACS干预DU145细胞，在24、48和72 h时，细胞增殖抑制作用的IC50分别是144.36、166.02和158.64 μg·mL-1;EACS干预PC3细胞，在24、48和72 h时，抑制增殖的IC50分别是357.51、219.81和203.81 μg·mL-1。以上6个值均比桐花树茎95%乙醇提取物对DU145、PC3细胞增殖抑制作用的IC50大，说明桐花树茎95%乙醇提取物对前列腺癌DU145、PC3细胞增殖抑制作用的活性成分不富集在EACS上，而在石油萃取物或者正丁醇萃取物中。

2.3 EACS對HT-29、DLD-1、SW480、DU145、PC3细胞集落形成的影响

EACS对人结肠癌细胞HT-29、DLD-1、SW480的集落形成干预效果见图3，对人前列腺癌细胞DU145、PC3及人卵巢癌细胞SKOV3-S的集落形成干预效果见图4。通过克隆形成实验，进一步证实了EACS对细胞HT-29、DLD-1、SW480、DU145、PC3、SKOV3-S的增殖抑制作用。如图3和图4所示，EACS对这6种细胞的克隆形成的抑制作用强度与浓度成正相关关系，药物浓度越高，抑制作用越强。在与对照组比较的情况下，EACS对SW480的克隆形成无明显的抑制效果，而对其他5种细胞的克隆形成的抑制效果较强，均具有统计学意义。

在12.5 μg·mL-1的EACS干预下，DU145细胞克隆形成数与空白对照组比较，差异具有极显著意义（P < 0.01）;而DLD-1、PC3、SKOV3-S细胞克隆形成数与对照组比较，差异在浓度为25.0 μg·mL-1时才具有极显著意义（P < 0.01）。在25.0 μg·mL-1 EACS干预下，HT-29细胞克隆形成数与对照组比较，差异具有显著意义（P < 0.05）。

3 讨论与结论

恶性肿瘤是目前世界上仅次于心血管疾病的第二大致死疾病。尽管现在有许多可应用于治疗恶性肿瘤的药物，但是这些药物往往会产生副作用。红树植物历来被人们用来治疗各种疾病，其中就包括治疗肿瘤。红树林植物生长于陆地与海洋的交界处，环境的特殊性使得红树植物易于产生新颖的次生代谢产物。目前为止，研究者发现多种红树植物具有抗肿瘤作用，并从中分离出了多种具有抗肿瘤活性的化学成分（韦林垚等，2018）。

红树植物的提取物或者从中分离出来的活性成分，它们的抗肿瘤机理各不相同，主要有阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制细胞转移和侵袭、抑制肿瘤血管生成等。从桐花树中分离出的抗肿瘤活性成分5-氧-乙基信筒子醌和5-氧-甲基信筒子醌阻断肿瘤细胞周期在G0/G1期，并诱导肿瘤细胞凋亡来抗肿瘤（徐岷涓等，2008）;从红海榄中分离出的环木菠萝苷可激活肿瘤细胞的Caspase-3和Capase7，从而诱导细胞凋亡（Huong et al，2014）;从白骨壤中分离出来的naphtho[1，2-b]sdfghijufuran-4，5-dione通过PI3K/Akt信号通路抑制MDA-MB-231细胞的转移和侵袭（Hsieh et al，2013）;小花老鼠簕的提取物可抑制VEGF的表达，从而抑制肿瘤血管生成（Mahasiripanth et al，2012）。通过文献检索发现，多种红树植物具有抗肿瘤活性，并且机理多种多样。此外，红树植物的抗肿瘤活性具有一定肿瘤选择性，如从红海榄叶中提取出来的环木菠萝苷对扁平上皮癌KB细胞、肺腺癌LU-1细胞、黑色素瘤SK-Mel-2细胞均具有显著的细胞毒性作用（Huong et al，2014），但在本研究中，红海榄叶95%乙醇提取物对前列腺癌DU145、PC3细胞无明显细胞毒性。同一种红树植物对不同肿瘤细胞增殖抑制作用不同，提示对同一红树植物提取物或者从中分离出来的抗肿瘤活性成分进行扩大肿瘤细胞系筛选是很有必要的。同时，要对筛选出的抗肿瘤活性成分进行进一步的抗肿瘤机理研究。

本研究中，通过对红海榄、秋茄、水黄皮、桐花树不同部位的95%乙醇提取物抗肿瘤活性的筛选，发现桐花树茎95%乙醇提取物对DU145细胞增殖抑制作用最强。红海榄叶95%乙醇提取物对前列腺癌DU145、PC3细胞增殖抑制作用的IC50大于800 μg·mL-1，推断其对前列腺癌DU145、PC3细胞不具有抗肿瘤活性。进一步对桐花树茎95%乙醇提取物进行分离，并选择了乙酸乙酯萃取物进行多种肿瘤细胞的抗肿瘤活性筛选，结果表明EACS对多种肿瘤细胞具有一定增殖抑制作用，但具有一定的选择性，对MHCC-97H、SMMC-7721、A549细胞增殖无明显抑制作用。EACS对DU145、PC3细胞增殖抑制作用比桐花树茎95%乙醇提取物小，表明在石油醚或者正丁醇萃取物中具有抗肿瘤作用更强的活性成分，应进一步研究桐花树茎石油醚、正丁醇萃取物的抗肿瘤活性。MTS实验中，EACS在48、72 h的干预下对结肠癌COLO205细胞增殖抑制作用最强，但因COLO205是半悬浮细胞，不利于进行集落形成实验，所以在集落形成实验中选择了细胞增殖抑制作用仅次于COLO205的DLD-1细胞及其同一肿瘤系的HT-29和SW480;此外还选择了乙醇提取物初筛抗肿瘤活性的前列腺癌DU145、PC3细胞。

通过对红海榄、秋茄、水黄皮、桐花树等广西四种红树植物抗肿瘤活性进行筛选研究，发现秋茄、水黄皮、桐花树均具有不同程度的抗肿瘤活性，其中桐花树的抗肿瘤活性最强。桐花树乙醇提取物的细胞增殖实验（MTS）和EACS的细胞增殖实验及集落形成实验，说明桐花树具有显著的抗肿瘤活性，并为进一步明确桐花树的抗肿瘤活性部位，从中发现活性成分提供了基础数据。后期可以该抗肿瘤活性筛选实验为指导，针对性研究具有抗肿瘤活性红树植物的化学成分，以期发现结构新颖、疗效显著的天然抗肿瘤药物。