高芬　郝锐　秦雪梅　雷振宏　王玉龙　王梦亮

[摘要] 该文以黄芪根腐病菌Fusarium solani为靶标，采用平板对峙和牛津杯法对被筛菌株进行了抑菌活性评价，并测定了抑菌效果显著且稳定性良好菌株的促生性能，结果显示：菌株G10的活体和发酵液均表现出了明显且稳定的抑菌效果；同时，还具有溶磷能力、固氮能力、淀粉酶活性、产IAA和产HCN等5项促生长特性。形态学观察、生理生化特性测定、16S rDNA序列同源性分析、以及BBL CrystalTM细菌鉴定仪鉴定结果均表明：菌株G10为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。综上，枯草芽孢杆菌G10具备了多功能菌株的基本特征，是开发黄芪根腐病专用微生物农药的有效物质基础。

[关键词] 黄芪根腐病； 植物根际促生菌； 筛选； 鉴定

In vitro screening and identification of plant growthpromoting

rhizobacteria against pathogen causing Astragalus root rot

GAO Fen1， HAO Rui2， QIN Xuemei3， LEI Zhenhong4， WANG Yulong4， WANG Mengliang1*

（1.Institute of Applied Chemistry， Shanxi University， Taiyuan 030006， China；

2.Institute of Biotechnology， Shanxi University， Taiyuan 030006， China；

3.Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine， Shanxi University， Taiyuan 030006， China；

4.Shanxi Zhendong Geoherbals Development Co.， Ltd.， Changzhi 047100， China）

[Abstract] The antagonistic effect of Bacillus spp. against Fusarium solani was evaluated by living body dual culture and Oxford cup method. The plant growth promoting properties of those strains that had obvious and stable antifungal activity were then tested. The results showed that the living body and bacteriafree fermentation filtrate of strain G10 both had obvious and stable antifungal effect to F. solani. Besides， the strain possessed such growth promoting properties as phosphate solubilization， nitrogen fixation， and production of IAA， amylase and HCN. Strain G10 was classified and identified as B. subtilis by a combination of morphological， physiological and biochemical tests， 16 SrDNA gene sequence analysis and the BBL CrystalTM bacteria identification. In conclusion， B. subtilis G10 has the basic characteristics of multifunctional strains and could be one of the microbiological resources for developing special biocontrol agent against Astragalus root rot.

[Key words] Astragalus root rot； plant growth promoting rhizobacteria（PGPR）； screening； identification

doi：10.4268/cjcmm20162217

植物根际土壤中的根际促生菌（PGPR）指生存于植物根际、根表，能直接或间接地促进植物生长，增加作物产量，并能抑制有害微生物的有益菌[1]。PGPR主要通过产生调节植物生长的信号物质，如吲哚乙酸、赤霉素、细胞分裂素和乙烯、非共生固氮、溶解磷矿物及其他养分等机制促进植物生长，同时也能产生嗜铁素和氢氰酸等抵抗病原菌[2]。芽孢杆菌作为一类重要的PGPR菌[3]，具有很强的环境适应性和友好性，在大田及蔬菜等的土传病害防治中显示出了巨大的潜力[46]。利用芽孢杆菌防治药用植物土传病害也有一些报道，例如：李忠等[7]分离获得的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis DY产生的抗菌物质对何首乌根腐病菌具有良好的拮抗作用；姜云等[8]从人参植株体内分离出的甲基营养型芽孢杆菌B. methylotrophicus NJ13对人参灰霉病、黑斑病、立枯病等具有广谱抗性；关一鸣等[9]发现枯草芽孢杆菌B. subtilis B11能强烈抑制人参根腐病菌的菌丝生长和孢子萌发。但上述这些拮抗菌的筛选，大部分局限于关注芽孢杆菌的抗菌特性，而未对其促生性能进行研究。

黄芪素有“十药八芪”之称，居于常用中药前列，近年来因需求量及种植面积的增加，根腐病逐年严重，在山西、甘肃、内蒙古等主产区均已普遍发生[10]，目前主要采用的化学和农业防治措施远远不能满足黄芪生产可持续发展和绿色环保的要求，因此，开发兼具防病效果和促生性能的高效PGPR多功能制剂，对促进黄芪产业的发展具有积极的推动意义。截止目前，利用芽孢杆菌对黄芪根腐病进行防治仅见辛中尧等[11]的个别报道，且未见后续产业化制剂形成。

基于上述原因，本课题组前期以山西黄芪根腐病优势病原菌腐皮镰刀菌Fusarium solani和锐顶镰刀菌F. acuminatum为靶标，初筛获得了30株具有抑菌作用的拮抗菌株，本研究拟通过综合评价这些菌株的抑菌活性及促生性能，筛选获得兼具抑菌促生作用的多功能菌株，并明确其分类地位，为开发针对黄芪根腐病的多效生防制剂提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与培养基

1.1.1 待测拮抗菌 由本实验室2013年7—10月分离自山西黄芪主产区健康植株根际土壤，并筛选获得。

1.1.2 靶标病原菌 黄芪根腐病优势病原菌F. solani，由本实验室分离、鉴定并保存。

1.1.3 发酵培养基 马铃薯20%，葡萄糖1.5%，NaCl 0.1%，KH2PO4 0.1%，其余为水。

1.1.4 促生性能测定培养基 Pikovaskaia′s培养基；硅酸盐培养基；无氮培养基（Nfb）；LB培养基；NB牛肉膏蛋白胨培养基。

1.2 待测菌株的体外抑菌活性测定

1.2.1 病原菌培养 菌块制备：挑取靶标菌F. solani接入PDA平板中央，25 ℃培养72～120 h，待菌落长满平皿后，打取直径5 mm的菌块，待用。孢子悬液制备：将菌块5块接入装有50 mL PD培养液的 250 mL三角瓶中，28 ℃摇床振荡培养（180 r·min-1）72 h，双层无菌纱布过滤，获得无菌丝的孢子悬液，加无菌水稀释至20～30个孢子/视野（10×15倍），置4 ℃冰箱备用。

1.2.2 拮抗菌培养 拮抗菌悬液制备：待测菌株28 ℃活化48 h后，制备菌悬液，使其终浓度为1.5×107～2.0×108 cfu·mL-1。无菌发酵滤液制备：菌悬液按体积比4%接种至50 mL的发酵培养基中（250 mL三角瓶），28～30 ℃摇床振荡（180 r·min-1）培养48 h后，8 000 r·min-1离心20 min，取上清液，用细菌过滤器（=0.22 μm）过滤菌体，得无菌发酵滤液，置4 ℃冰箱备用。

1.2.3 活体抑菌活性的测定 平板对峙法：将病原菌菌饼接于PDA平板中央，再将活化后的待测菌株呈十字交叉点接在距菌饼2 cm处的4个角上，25 ℃恒温培养；72 h后测量抑菌带宽度并计算菌落生长抑制率。菌落生长抑制率=（对照菌落净生长半径-处理菌落净生长半径）/对照菌落净生长半径×100%。

1.2.4 发酵液抑菌活性的测定 牛津杯法：将病原菌孢子悬液加入熔融态PDA培养基中（每500 mL PDA中加入400 μL），迅速混匀并制成平板（20 mL/皿）。在混菌平板上等距离放置无菌牛津杯3个，加入200 μL无菌发酵滤液，25 ℃培养48 h后，十字交叉法测量抑菌圈直径。上述试验均以无菌水为对照，3次重复。

1.3 待测菌株的促生性能测定

经上述抑菌活性测定，抑菌效果显著且稳定性良好的菌株进入促生性能测定。

1.3.1 溶磷性能测试 菌株点接于Pikovaskaia′s培养基中，每皿接种4点，每1菌株3皿，30 ℃培养120 h，观察接种菌株周围有无溶磷圈形成，判断该菌株有无溶磷性[12]。

1.3.2 解钾能力测定 菌株点接于硅酸盐培养基中，每皿接种4点，每1菌株3皿，30 ℃培养24～72 h，观察菌落形态和溶钾圈大小[13]。

1.3.3 固氮性能测定 菌株穿刺接种于含有0.5%蔗糖的无氮NFb半固体培养基试管中，30 ℃静置培养72 h，观察是否有菌环或菌膜生成，以未接种的空白培养基为对照[14]。

1.3.4 淀粉酶活性测定 菌株接种于含有0.2%可溶性淀粉的NB牛肉膏蛋白胨固体平板上，30 ℃静置培养72 h，形成明显菌落后，在平板上滴加碘液，观察菌落周围变色情况并测量酶解圈大小[15]。

1.3.5 分泌IAA能力的测定 菌株接种于含有 L色氨酸（100 mg·L-1）的LB液体培养基中，30 ℃摇床培养（180 r·min-1）24 h后，取50 μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加入等体积Salkowski比色液（50 mL 35% HClO4 + 1 mL 0.5 mol·L-1 FeCl3），将白色陶瓷板于室温避光放置 30 min 后观察，颜色变红者表示能够分泌IAA。以加入50 μL未接菌的 LB 液体培养基与等体积比色液的混合溶液为对照[16]。

1.3.6 产HCN鉴定 在NB培养基中添加4.4 g·L-1甘氨酸，将菌株划线接种于该平板上，另将浸过2%碳酸钠，0.5%苦味酸溶液（2，4，6三硝基苯酚）的Whatman 1号滤纸置于培养基上，密封，（30±2） ℃培养96 h，滤纸颜色由橘黄色转为红色的说明有 HCN产生[17]。

1.4 多功能菌株G10的多相分类鉴定

1.4.1 菌株形态、生理生化特征观察 参照《常见细菌系统鉴定手册》[15]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[18]，观察并测定菌株G10的生长情况、菌落形态与颜色、革兰氏染色和芽孢染色等形态与生理生化特征。

1.4.2 菌株G10 的16S rDNA序列测定与分析 采用CTAB法提取基因组DNA并作为模板，利用细菌16S rDNA 基因通用引物27F（5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′）和1495R（5′CTACGGCTACCTTGTTACGA3′）进行扩增[19]。PCR 反应体系为 25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，引物（25 pmol·L-1）各 1 μL，dNTP Mixture 2.5 μL，Taq DNA Polymerase（5 U·μL-1）0.5 μL，ddH2O 15.5 μL，DNA 模板 2 μL。反应条件：95 ℃预变性 4 min，95 ℃变性 l min，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，共30个循环；然后72 ℃保持7 min[20]。扩增产物由上海生工测序，测得的基因序列与GenBank中已知的 16S rDNA序列进行同源性比对，采用 MEGA 5.05构建系统发育树。

1.4.3 采用BBL Crystal细菌鉴定仪验证菌株G10鉴定结果 将培养好的菌株G10用无菌棉签挑取适量配制成0.5～0.6 McFarland的菌悬液，并倒入盛液盒两端，左右倾斜使菌液沿轨道均匀充满每个孔，然后将试剂板与盛液盒合上，并做标记。将接种完成的鉴定板标签朝下置于35～37 ℃的培养箱中培养24～48 h后，将培养完成的鉴定板取出，在AutoReader上判读鉴定结果。

2 结果和分析

2.1 拮抗菌的体外抑菌效果

30株菌的平板对峙测定结果表明，有16株菌抑菌效果明显，抑菌带宽度在2～6.67 mm，菌落生长抑制率在13.96%～40.85%，重复测定后效果稳定（表1）。其中，菌株R102与G10的抑菌带及抑制率数值虽然较小，但二者的抑菌带边缘整齐、清晰、靶标菌菌落整体生长较小，因此选择上述16株菌进入下步发酵液抑菌活性测定。

芽胞杆菌制剂一般为发酵生产，发酵液所能达到的抑菌效果和活菌含量是决定微生物农药药效的重要因素。菌株的发酵液抑菌活性测定结果表明，有8株菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径在10.58～19.33 mm，且重复发酵后效果稳定。经方差分析表明，G2，R43，G14，G16，G10发酵液的抑菌圈最大，且五者之间无显著差异（P<0.05）；R53与G3次之，二者之间也无显著差异（P<0.05）；R35的抑菌圈最小（表2）。可见这8株菌满足后续制剂生产的需求，可进入促生能力测定，进而从中筛选兼具抑菌和促生功能的高效菌株。

2.2 拮抗菌的促生性能测定

若使拮抗菌在田间更好的发挥作用，在测定指标中具有多项促生能力是选择的前提。本试验结果显示，供试拮抗菌均具有2项以上促生能力（表3）；其中，菌株G10具有5种促生能力，分别为溶磷能力、固氮能力、淀粉酶活性、产IAA能力与产HCN能力。同时，该菌发酵液的抑菌活性在8株菌中，与活性最好的G2，R43，G14，G16相当。据此，选择菌株G10作为后续研究的目标菌株，并对其进行鉴定。

2.3 菌株G10的多相分类鉴定

2.3.1 形态学及生理生化特征 菌株G10在 PDA 平板表面生长的菌落为圆形至近圆形，灰红色，边缘锯齿状，湿润，不透明；菌体形态为杆状，大小为（0.62～0.90）μm×（2.71～3.37）μm，革兰氏染色为阳性，芽孢一般在菌体中间。测定生理生化特性（表4），参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》的检索表检索可知，拮抗菌G10为枯草芽孢杆菌B. subtilis。

2.3.2 16S rDNA序列分析与系统进化树构建 以基因组DNA为模板，利用特异引物扩增并测序，测得菌株G10 16S rDNA的核苷酸序列长度为1 459 bp，将该序列提交到GenBank（登录号KX427026），并与数据库中的已知序列进行核苷酸序列的同源性比对，同时运用软件MEGA 5.05建立系统发育树Test Neighborjoining Tree（图1），结果表明，菌株G10与B. subtilis的 16S rDNA基因同源性最高，达97%。结合菌体形态、生理生化试验结果，将菌株G10鉴定为枯草芽孢杆菌B. subtilis。

2.3.3 利用BBL Crystal细菌鉴定仪验证鉴定结果 细菌鉴定仪对菌株G10再次鉴定的结果表明：菌株G10为枯草芽孢杆菌B. subtilis，该结果与形态、生理生化试验和16S rDNA序列分析的鉴定结果一致。

3 结论与讨论

根际促生菌（PGPR）对植物的有益作用主要表现在防病和促生2个方面[21]，PGPR中的PGPB在药用植物上的应用前提就是从道地药材土壤或内生细菌中分离出具有促生特征的菌株[22]。本试验研究发现，来源于黄芪根际土壤的菌株G10不仅对黄芪根腐病优势病原菌F. solani有良好的抑菌作用，且兼具多项促生功能。氮是黄芪地上部分及旺盛生长时期最主要的营养元素[23]，同时也是植物体内叶绿素、蛋白质等许多重要化合物的组分[24]；磷的缺乏则可导致黄芪生长缓慢，植株瘦小，使叶片呈现不正常的颜色[24]，而菌株G10不仅可以在无氮培养基中生长，具有自身固氮作用，而且有较好的溶磷作用，在根际施用时，不仅可提高黄芪对氮源的利用率，同时也能提高难溶性磷酸盐的溶解性，改善磷素营养，供黄芪吸收利用。IAA在植物体内参与细胞伸长生长、形成层细胞分裂、维管组织分化等许多生理生化过程的调节与控制，并对植物的顶端优势、向性、同化物的运输等也有调节作用[25]，菌株G10可以产生IAA的特性，说明其也可促进黄芪生长，增加产量。另外，黄芪种子外皮坚实而厚，吸水能力差，在正常温、湿度条件下约有80%的种子不能萌发[26]，基于解淀粉酶可促进种子萌发的作用，菌株G10也可通过产生解淀粉酶来促进黄芪种子的萌发，更好地保障出苗率。由此可以看出，菌株G10的促生性能很好地符合了黄芪的生长特性，更利于根腐病的防治和黄芪的生长。

多相分类鉴定结果表明，菌株G10为B. subtilis。B. subtilis作为芽孢杆菌属的重要成员，其在植病生防方面的潜能已被发掘，且针对各类土传病害开发出了在生产上广泛使用的制剂，获得了良好的经济和社会效益[2728]。由此说明，本课题获得的B. subtilis G10可作为黄芪根腐病多功能生防制剂开发的良好微生物资源，具有较大的开发潜能。

但是，对于在室内平板上表现出良好抑菌促生作用的菌株，还需进行盆栽或小区实验来最终确定其实际应用效果。由于黄芪生长对环境有着特殊的需求[29]，在现有温室和露天盆栽条件下，多次进行人工直播和移栽，均出现出苗率低、后期生长不良、生长十分缓慢等现象，无法满足盆栽实验的条件，因此考虑在完成发酵条件优化后，在黄芪种植基地进行小区实验，来最终明确其实际的抑菌促生效果。同时，促生作用目前也只进行了是否具有促生功能的研究，而各项能力的大小，还有待进一步明确。

另外，拮抗枯草芽孢杆菌有多种抑菌机制[27]，且防病效果往往是多种机制共同作用的结果。本文仅明确了G10能通过产HCN拮抗病原菌，该菌是否还有其他抑菌防病机制仍待研究。

综上可知，G10已经具备了多功能菌株的基本特征，若能开发为微生物农药或肥料应用于生产，可以一定程度上缓解黄芪根腐病的发生，促进黄芪的增产增收，但还需进行后续深入研究为制剂开发奠定基础。

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[责任编辑 吕冬梅]