巫静帆李小霞谭淑娟付有晴杨茜朱鹏远马秋林周光纪刘彦慧

1广东医科大学医学检验系（东莞523000）2广东省东莞市妇幼保健院产科（东莞523000）3广东省东莞市妇幼保健院耳鼻喉科（东莞523000）4广东省东莞市妇幼保健院产前诊断中心（东莞523000）5东莞市博奥木华基因科技有限公司（东莞523808）

先天性听力障碍是常见的出生缺陷之一。中国第二次残疾人抽样调查数据显示，听力及言语残疾人高达2780万，7岁以下聋儿约80万，且以年均3万的速度增长[1]，加上迟发性和药物性耳聋，每年将新增6-8万耳聋患者[2]。导致听力障碍的因素包括遗传、环境及两者共同作用三大类，遗传性耳聋包含最常见的3个基因，分别为GJB2、SLC26A4、线粒体12SrRNA，但不同地区突变热点存在差异。突变位点的差异对制定有效的预防、干预措施具有指导意义。本研究采用遗传性耳聋基因芯片检测技术对东莞户籍新生儿耳聋基因进行了检测，并对部分样本联合听力筛查进行了检测与分析，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2016年1月至2017年2月期间，在东莞地区40家医院出生的新生儿，这些新生儿的父母至少有一方是东莞户籍。

1.2 听力筛查方法

新生儿于出生2-3天后采用耳声发射法(otoacoustic emission,OAE)进行初次听力筛查，初筛不通过者在出生后29-42天进行复筛，复筛采用OAE与自动判别听性脑干诱发电位法(auto auditory brainstem response,AABR)结合检测。复筛未通过者，于3月龄进行听力诊断。

1.3 耳聋基因检测方法

新生儿出生1-3天内采集足跟血2-5滴，血斑直径8mm，制成干血片。参照干血斑基因组DNA提取标准操作规程提取基因组DNA，应用晶芯®九项遗传性耳聋基因检测试剂盒（微阵列芯片法）对4个耳聋基因的9个位点进行检测，包括GJB2（c.235delC， c.299_300delAT， c.176_191del16，c.35delG）、SLC26A4（IVS7-2A＞G，c.2168A＞G）、线粒 体 12SrRNA（m.1555A＞G，m.1494C＞T）和 GJB3（c.538C＞T）。仪器为PCR扩增仪（博日TC-96/G/H(b)）、晶芯®SlideWasherTM芯片洗干仪、HybSet基因微阵列芯片杂交盒、晶芯®LuxScanTM10K/B微阵列芯片扫描仪。试剂与仪器均由博奥生物集团有限公司提供。

1.4 统计学处理

建立EXCEL数据库，采用SPSS15.0进行卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新生儿听力筛查结果

在进行了耳聋基因与听力筛查联合分析的6242例新生儿中，初筛未通过446例，初筛阳性率7.15%。初筛未通过者在29-42天时接受复筛，复筛未通过103例，复筛阳性率1.65%。听力筛查未通过者中有63例进行了听力诊断，最终确诊13例耳聋患者，分别为双耳极重度感音神经性耳聋2例，左耳极重度感音神经性耳聋/右耳中重度感音神经性耳聋1例，右耳极重度耳聋1例，左耳重度感音神经性耳聋1例，双耳中度感音神经性耳聋4例，右耳中度耳聋1例，双耳轻中度耳聋1例，双耳轻度听力损失1例，左耳听反应域轻度异常1例。

2.2 新生儿耳聋基因筛查结果

共完成33810例新生儿检测，检出耳聋基因突变新生儿1129例，其中GJB2c.235delC纯合突变3例，双杂合突变13例，详见表1。另发现线粒体基因突变72例，包括线粒体DNA均质突变49例，异质突变23例。

以等位基因计算，共发现突变等位基因1145个，突变携带率约为3.39%（1145/33810），其中GJB2突变携带率约为1.96%（661/33810），SLC26A4突变携带率约为1.08%（364/33810），线粒体12SrRNA突变携带率约为0.22%（74/33810），GJB3突变携带率约为0.14%（46/33810），详见表2。在进行检测的9个位点中，排在前五位的突变位点依次 是 c.235delC、IVS7-2A＞G、c.299_300delAT、m.1555A＞G、及c.2168A＞G。

2.3 新生儿听力与耳聋基因联合筛查结果

6242 例新生儿听力与耳聋基因联合筛查结果显示，基因筛查通过的5937例新生儿中，听力筛查通过5855例，未通过率1.38%，基因筛查未通过的305例新生儿中，听力筛查通过284例，未通过率6.89%，两者差异有统计学意义（χ2=54.153，P＜0.01)。

305 例基因筛查未通过新生儿中有GJB2基因突变162例，包括c.235delC杂合突变140例、c.299_300delAT杂合突变17例、c.176_197del杂合突变2例、c.235delC纯合突变3例，其中纯合突变有3例没有通过听力筛查，杂合突变有15例没有通过听力筛查，未通过率11.11%；SLC26A4基因突变有59例，其中IVS7-2A＞G杂合突变52例，c.2168A＞G杂合突变7例，有1例未通过听力筛查，未通过率1.69%；m.1555A＞G突变有40例，其中均质突变28例，异质突变12例，全部通过听力筛查；GJB3基因的c.538C＞T杂合突变有31例，全部通过听力筛查。13例双杂合突变中有2例c.235delCIVS7-2A＞G未通过听力筛查，未通过率15.38%。听力筛查未通过者中有63例进行了听力诊断，最终确诊13例耳聋患者，其中有4例基因未通过，分别为c.235delC纯合突变3例和c.235delCIVS7-2A＞G双杂合突变1例，其余9例均未发现检测范围内的基因突变。

3 讨论

表1 纯合及双杂合突变病例情况Table 1 Cases of homozygous and heterozygous in various genes

导致听力障碍的因素较为复杂，有遗传因素、环境因素或者两者共同作用，其中遗传因素约占50%～60%[3]，而由此导致的新生儿听力障碍目前无理想治疗措施，但可控可防，即通过对携带耳聋基因突变的新生儿进行预防指导，可避免或推迟耳聋的发生，但耳聋基因及突变谱存在地域和种族差异[4-5]，因此，基因检测对降低耳聋的发生率具有重要意义。本次研究共完成东莞户籍新生儿检测33810例，检出携带者1129例，约占总数的3.34%，4个基因9个突变热点共检出1145个，突变率约为3.39%，该数据低于文献报道的4.17%～5.15%[6-8，10-11]。

表2 4种基因9个位点的突变携带率Table 2 The carrie rate of nine hot spots

表2显示，4个基因突变检出率从高到低依次为GJB2、SLC26A4、线粒体12SrRNA和GJB3，基因突变位点频率前5位依次为c.235delC、IVS7-2A＞G、c.299_300delAT、m.1555A＞G及c.2168A＞G，与文献相似[7,9,10]。但具有特点，其中共检出GJB2基因突变者658例（58.28%），该基因的携带率约为1.96%，其中c.235delC约占突变数的86.84%，高于文献报道[9,12]，而c.299_300delAT和c.176_191del16突变率显著低于文献报道[6-8]，提示东莞地区户籍人群以c.235delC为突变热点。SLC26A4是仅次于GJB2的感音神经性耳聋遗传基因，是迟发性耳聋发生的重要基因，本次检出364例突变携带者，占总突变人群的32.24%，突变携带率约为1.08%，低于文献报道的1.50%～2.07%[6,7,10]。GJB3基因突变共检出46例，占总突变人群的4.07%，突变携带率约为0.14%，低于文献报道的0.295%～0.32%[6-7]。东莞户籍新生儿耳聋基因突变的这些独特性可能与以下原因有关：首先是地域性，东莞地处珠江口东岸，是岭南文化发源地，同时也是我国改革开放的先行地，是我国移民第二多城市，仅次于深圳，总人口1000万左右，但户籍人口仅占约20%，本研究为尽可能保证遗传背景的一致性，选择夫妻双方或一方为东莞户籍的新生儿作为检测对象，但并非均为土著居民，遗传背景并不完全一致。其次，本次为大规模样本研究，而文献报道均为小样本研究。最后，本次仅对导致耳聋的4个基因9个位点进行检测，而与听力相关基因突变位点高达100余个，因此，作者无法排除本地区是否存在其他基因突变的可能性。

另外，从表1中作者发现，耳聋基因也具有遗传异质性。表1中7例GJB2基因的c.235delC和SLC26A4基因的IVS7-2A＞G双重杂合突变，在未通过听力筛查的2例中，仅有1例诊断为左耳极重度感音神经性耳聋，右耳中重度感音神经性耳聋，并佩戴了助听器，而另1例却无听力障碍临床症状，此例虽然未通过首次听力筛查，但经6个月后的随访证实对声音反应良好，其他5例均通过听力筛查。其可能的原因是：1.致聋的患儿携带有其它位点突变；2.受环境影响致聋[8,13-16]。

本研究显示，6242例进行联合筛查的新生儿中有305例未通过基因检测，听力筛查未通过21例，漏检284例，大部分基因携带者、药物性耳聋患儿均通过了听力筛查，但在其成长过程中受外界环境影响可导致听力损伤甚至终生耳聋，比如线粒体DNA12SrRNA突变为母系遗传，其子代均为突变基因携带者，使用氨基糖苷类抗生素可导致不可逆转的听力残疾[17-19]，又如GJB3基因突变可引起常染色体显性或隐性遗传性非综合征耳聋，与高频听力下降有关[20,21]，且有GJB2/GJB3双杂合突变致病的模式[22]，故需定期进行听力监测。进行基因检测不仅可以明确病因，还可以有针对性地对高危人群进行用药指导、行为指导以及婚育指导，可见耳聋基因筛查是早期发现迟发性耳聋和药物性耳聋的有效手段。但由于基因筛查无法发现由耳部结构畸形、分泌性中耳炎等非遗传因素导致的耳聋，同时由于检测位点的局限性，也会造成部分患者的漏诊，本文中有未通过听力筛查的新生儿103例，其中仅21例携带致病突变，而确诊的13例患者有9例未检测出基因突变；可见两种方法具有互补性。

耳聋基因筛查是早期发现新生儿听力障碍的重要辅助检测方法，本次研究基本明确了东莞地区遗传性耳聋的突变分布情况。另外，听力筛查和耳聋基因筛查具有很好的互补性，通过联合筛查能够从分子水平发现有可能存在听力损伤的新生儿，对药物性耳聋高危患儿的终生用药提供指导，减少迟发性耳聋高危新生儿的发病率和降低患儿的听力损失严重程度，并能及时对患儿听力状况作出评估，有助于降低耳聋出生缺陷率；对遗传性耳聋高危患儿进行定期听力检查，为早期发现、预测耳聋的发生及制定干预措施提供了有利的参考，对降低耳聋发病率有重要意义[23-24]。

参考文献

1 图书:第二次残疾人抽样调查办公室.全国第二次残疾人抽样调查主要数据手册[M].华夏出版社,2007:2,38.Office.of Second Disability Sampling Survey.Main Data of the Sec-ond National Survey for the Disabl-ed[M].Huaxia Publishing House,2007:2,38.

2 章雪芹,魏澄,王栋,等.遗传性耳聋基因筛查在新生儿听力筛查中应用研究[J].中国实用妇科与产科杂志,2016,(3):273-275.Zhang XQ,Wei C,Wang D,et al.Research on the Significance of Gene Screening for Genetic Deafness in Neonatal Hearing Screening[J].Chinese Scientific Journal of Hearing and Speech Rehabilitation,2016,(3):273-275.

3 Mahboubi H,Dwabe S,Fradkin M,et al.Genetics of Hearing Loss:Where are We Standing now?[J].European Archives of Oto-Rhino-Laryngology,2012,269(7):1733-1745.

4 刘学忠,欧阳小梅,DeniseYan,等.中国人群遗传性耳聋研究进展[J].中华耳科学杂志,2006,4(2):81-89.Liu XZ,Ouyang XM,Yan D,et al.The Genetic Deafness in Chinese Population[J].Chinese Journal of Otology,2006,4(2):81-89.

5 戴朴,袁永一.基于基因筛查和诊断的耳聋出生缺陷三级预防[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2013,48(12):973-977.Dai P,Yuan YY.Three-level Prevention of Deafness Birth Defects based on Gene Screening and Diagnosis[J].Chinese Journal of Otorhinolaryngology Head and Nech Surgery,2013,48(12):973-977.

6 Han S,Yang X,Yi Z,et al.Deafness Gene Mutations in Newborns in Beijing[J].Acta Oto-Laryngolog-ica,2016,136(5):475-479.

7 李晓泽,马卫平,胡志鹏,等.长治地区19113例新生儿耳聋基因检测[J].中华耳科学杂志,2015,(4):654-657.Li XZ,Ma WP,Hu ZP,et al.ChangZhi District 19113 Cases of Neonatal Deafness Gene Detection[J].Chinese Journal of Otology,2015,(4):654-657.

8 相丽丽,林倩,聂文英,等.济南市部分新生儿听力和耳聋基因联合筛查结果分析[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2015,50(5):401-405.Xiang LL,Lin Q,Nie WY,et al.Study of Newborn Hearing and Genetic Screening in Jinan[J].Chinese Journal of Otorhinolaryngology Head and Nech Surgery,2015,50(5):401-405.

9 吕康模,熊业华,俞皓,等.17000名新生儿遗传性耳聋基因突变筛查[J].中华医学遗传学杂志,2014,31(5):547-552.Lv KM,Xiong YH,Yu H,et al.Screening of Common Deafness Gene Mutations in 17000 Chinese Newborns from Chengdu based on Microarray Analysis[J].Chinese Journal of Medical Genetics,2014,31(5):547-552.

10 Yin AH,Liu C,Zhang Y,et al.The Carrier Rate and Mutation Spectrum of Genes Associated with Hearing Loss in South China Hearing Female Population of Childbearing Age[J].BMC Medical Genetics,2013,14(1):57.

11 熊怡,钟梅,李欣,等.中山市新生儿听力筛查联合耳聋基因检测结果分析[J].妇产与遗传:电子版,2016,6(1):25-29.Xiong Y,Zhong M,Li X,et al.Analysis of the Data of Otoacoustic Emissions Combining with DNA Microarray for Newborn Hearing Screening in Zhongshan[J].Obstetrics-Gynecology and Genetics,2016,6(1):25-29.

12 余红,刘丹,杨晶群,等.2725名新生儿耳聋基因热点突变的筛查分析[J].中华医学遗传学杂志,2015,32(3):335-338.Yu H,Liu D,Yang JQ,et al.Analysis of Common Mutations of Deafness-related Genes in 2725 Newborns[J].Chinese Journal of Medical Genetics,2015,32(3):335-338.

13 余红,杨晶群,樊洁敏,等.遗传性耳聋基因SLC26A4阳性携带婴儿2年随访结果分析[J].中国妇幼卫生杂志,2016,7(4):62-64.Yu H,Yang JQ,Fan JM,et al.Follow-up Results of Infant Carried Positive Hereditary Deafness Gene SLC26A4[J].Chinese Journal of Maternal and Child Health,2016,7(4):62-64.

14 李琦,黄德亮,朱庆文,等.感音神经性耳聋患者大前庭导水管综合征相关SLC26A4基因IVS7-2A＞G的全序列分析[J].中华医学遗传学杂志,2010,27(6):610-615.Li Q,Huang DL,Zhu QW,et al.Sequencing Analysis of Whole SLC26A4 Gene in Severe to Profound Sensorineural Hearing Loss Patients with IVS7-2A＞G Mutation of the Gene[J].Chinese Journal of Med-ical Genetics,2010,27(6):610-615.

15 贾婧杰,袁永一,戴朴,等.山东省滨州市特教学校耳聋学生分子病因学分析—GJB2235delC突变、线粒体DNA12SrRNAA1555G突变和SLC26AIVS7-2A＞G突变筛查报告[J].中华耳科学杂志,2010,08(4):407-410.Jia JJ,Yuan YY,Dai P,et al.Molecular Etiology Analysis among Students with Profound Hearing Loss in a Special Education School in Shandong[J].Chinese Journal of Otology,2010,08(4):407-410.

16 张昊昱,张宁,张华,等.耳聋基因检测在遗传性耳聋诊断及遗传咨询中的应用[J].中华耳科学杂志,2016,14(5):639-643.Zhang HY,Zhang N,Zhang H,et al.The Application of Genetic Testing of Deafness Genes in Hereditary Deafness Diagnosis and Genetic Counseling[J].Chinese Journal of Otology,2016,14(5):639-643.

17 Rydzanicz M,Wróbel M,Pollak A,et al.Mutation Analysis of Mito Chondrial 12S rRNA Gene in Polish Patients with Nonsyndromic and Aminoglycoside-induced Hearing Loss.[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,395(1):116-121.

18 Wang QJ,Li QZ,Han D,et al.Clinical and Molecular Analysis of a Four-generation Chinese Family with Aminoglycoside-induced and Nonsyndromic Hearing Loss Associated with the Mitochondrial 12SrRNA C1494T Mutation[J].Biochemical Biophysical Research Communications,2006,340(2):583-588.

19 Guan M X.Molecular Pathogenetic Mechanism of Maternally Inherited Deafness.[J].Annals of the New York Academy of Sciences,2004,1(3):259-271.

20 Xia JH,Liu CY,Tang BS,et al.Mutations in the Gene Encoding Gap Junction Protein beta-3 Associated with Autosomal DominantHearing Impairment[J].Nature Genetics,1999,20(4):370-373.

21 Liu XZ,Xia XJ,Xu LR,et al.Mutations in Connexin31 Underlie Recessive as well as Dominant Nonsyndromic Hearing Loss.[J].Human Molecular Genetics,2000,9(1):63.

22 Liu XZ,Yuan Y,Yan D,et al.Digenic Inheritance of Nonsyndromic Deafness caused by Mutations at the Gap Junction Proteins Cx26 and Cx31[J].Human Genetics,2009,125(1):53-62.

23 王秋菊，赵亚丽，兰兰，等.新生儿聋病基因筛查实施方案与策略研究[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2007,42(11):809-813.WANG QJ,Zhao YL,Lan L,et al.Studies of the Strategy for Newborn Gene Screening[J].Chinese Journal of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery,2007,42(11):809-813.

24 WANG QJ,Zhao YL,Rao SQ,et al.Newborn Hearing Concurrent Gene Screening can Improve Care for Hearing Loss:A Study on 14,913 Chinese Newborns.Int J Pediatr Otorhinolaryngol.2011,75(4):535-542.