于晓宇 林妘 许军 杨涛 吴皓

上海交通大学医学院附属第九人民医院耳鼻咽喉头颈外科上海交通大学医学院耳科学研究所上海市耳鼻疾病转化医学重点实验室

大前庭导水管（Enlarged vestibular aqueduct,EVA）是与儿童感音神经性聋相关的最常见的内耳畸形[1]。大部分EVA患者表现为非综合征型耳聋(DFNB4,OMIM#600791），少部分同时合并甲状腺肿大，称Pendred综合征（Pendred syndrome,PDS,OMIM274600）。研究表明，SLC26A4的双等位基因突变是导致EVA的主要病因[2,3]。SLC26A4基因有21个外显子，编码含780个氨基酸的多次跨膜蛋白Pendrin.Pendrin表达于内耳、甲状腺和肾脏，能够介导 Cl-、I-、OH-、HCO3-等阴离子的转运[4,5]。至今已报道有近200种SLC26A4基因的致病突变，其突变谱在不同的地区和种族中存在差异。例如，SLC26A4基因的热点突变在白种人中为p.L236P,p.T416P和c.1001+1G＞A[6]，在日本和韩国人中为p.H723R[7,8]，而中国人群中，c.919-2A＞G突变最常见[9]。同时，SLC26A4基因突变的检出率也存在种族差异，据报道SLC26A4双等位突变的检出率在北美白种人为33%，而在中国汉族EVA患者中携带SLC26A4双等位突变的占88%。本研究旨在通过对中国华东地区135例非综合征性EVA耳聋先证者进行SLC26A4基因突变检测，进一步了解EVA耳聋患者SLC26A4基因突变检出率和突变谱，为指导临床基因诊断和遗传咨询提供线索和依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料

本研究的135例研究对象为2009年10月至2017年1月就诊于上海交通大学医学院附属新华医院耳鼻咽喉头颈外科耳科学或遗传学门诊的EVA耳聋患者。所有患者均经高分辨率颞骨CT或者磁共振成像(MRI)诊断为EVA，诊断依据为轴位CT扫描显示患者前庭总脚至前庭水管外口之间中点的最大管径宽度＞1.5 mm[10]。对所有研究对象均进行详细的病史询问及体格检查以排除其他致病因素造成的听力损失和综合征性耳聋。听力学检查根据患者的年龄和配合程度选择纯音测听、行为测听或听觉脑干反应(Auditory brainstem response,ABR)检测。听力损失程度的分级根据2003年Van camp等[11]欧洲工作组倡导的遗传性耳聋的分级标准：轻度（20～ 40 dB HL）、中度（41～70 dB HL）、重度（71～95 dB HL）及极重度（＞95 dB HL）。本研究通过上海交通大学医学院附属新华医院伦理委员会的批准，所有研究对象均被详细告知权利和风险，并由本人或法定监护人签署书面知情同意书。

2 方法

2.1 DNA提取

使用天根生化科技（北京）有限公司的基因组DNA提取试剂盒，参照试剂盒内说明书从全血中提取基因组DNA，并利用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计对所提DNA进行含量和纯度检测。

2.2 巢式聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)和Sanger测序

针对SLC26A4基因的编码区及侧翼序列分别设计巢式PCR引物进行分段扩增，根据引物参数确定最佳反应条件。PCR所使用引物序列、试剂、反应条件和反应体系详见柴永川等[12]。所得巢式PCR产物直接由上海杰李生物技术有限公司进行Sanger测序，并使用Sequencher 4.9序列分析软件对测序结果进行分析。

2.3 统计分析

利用SPSS 20统计学软件中的秩和检验对携带不同数量SLC26A4突变的EVA患者的听力损失程度进行统计分析。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

3 结果

本研究共收集到符合EVA诊断标准的先证者135例，其中男性67例，女性68例，患者年龄1月～32岁，中位年龄4岁。SLC26A4基因编码区突变检测在135例EVA耳聋患者中共检测出存在于210等位基因上的51种突变，其中，最常见的是剪切位点突变c.919-2A＞G，占总检出突变的50%(105/210)，其次是错义突变p.H723R，占10.48%(22/210)。所有先证者中，74.07%（100/135）的患者携带有SLC26A4双等位基因突变，7.41%的（10/135）的先患者携带SLC26A4单等位基因突变，而18.52%（25/135）的患者未检测到任何SLC26A4基因突变。135例患者的SLC26A4基因突变情况详见表1。听力学资料显示，携带有SLC26A4双等位基因突变、单等位基因突变和无SLC26A4基因突变的3组先证者的听力损失程度无明显统计学差异(见表2)。

表1 135例EVA耳聋患者SLC26A4基因外显子突变筛查结果Table1 SLC26A4 coding region mutations in 135 probands with non-syndromic EVA

Allele 1 p.L676Q p.M147V p.N392Y p.N392Y p.Q446X p.R409C p.T410M p.T410M V659L c.1548insC c.1707+5G＞A c.414delT c.915-916insG c.915-916insG c.919-2A＞G c.915insG p.H723R p.S532R p.V163I p.V412I none Total Allele 2 p.H723R p.H723R p.I529S p.S532R p.H723R p.H723R p.D661Y p.H723R N392Y+K77I p.N392Y p.V650D p.N392Y p.M147V c.1707+5G＞A none none none none none none none Number of subjects(%)1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）5（3.70）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）25（18.52）135（100）

表2 SLC26A4双等位基因突变、单等位基因突变及无SLC26A4基因突变患者的听力损失程度Table 2 Severity of hearing loss in subjects with two,one or zero SLC26A4 mutations

4 讨论

SLC26A4是EVA耳聋患者主要的致病基因。自从1997年被鉴定以来，在世界范围内已经发现近200种SLC26A4致病突变类型，但已报道的EVA耳聋患者SLC26A4基因的突变率和热点突变存在着明显的地域和种族差异。本文通过对华东地区135例散发EVA耳聋先证者的SLC26A4基因筛查研究共检测出51种突变，其中最常见的是剪切位点突变c.919-2A＞G和错义突变p.H723R，分别占总检出突变的50%和10.48%，与之前华北地区及台湾地区的报道一致[2,9]。与之前报道不同的是EVA耳聋先证者中未检出SLC26A4双等位基因突变的患者比例。Wang等[9]报道的非SLC26A4双等位基因突变的EVA耳聋患者比例为11.6%，包含9.5%SLC26A4单等位基因突变的病例和2.1%的未检出SLC26A4等位基因突变的病例；Chen等[13]报道的中国台湾地区EVA耳聋患者中，SLC26A4单等位基因突变的病例占24%，未见SLC26A4等位基因突变的病例占14%，而本研究显示华东地区未检出SLC26A4突变的EVA患者比例较高，存在这种差异可能有两个原因：1.样本人群的地域和民族差异。中国是一个地域广阔的多民族国家，南北方之间及不同民族之间可能存在着一定的遗传差异。2.样本中所含家族性EVA耳聋患者的比例不同，本研究中有EVA家族史的患者仅有4例，低于之前报道中有EVA家族史的患者例数。

EVA耳聋作为隐性遗传疾病，有一部分患者在主要致病基因SLC26A4编码区未检出双等位基因突变，提示可能存在其他遗传因素在EVA耳聋中起着重要作用，如SLC26A4基因大片段缺失、内含子突变、SLC26A4基因调控序列突变以及SLC26A4基因之外其它致病基因的影响。以上假设已在部分研究中得到证实，例如Pique等[14]利用多重连接探针扩增技术(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification,MLPA)发现1例（1/107）携带SLC26A4单杂合突变的患者存在SLC26A4基因的杂合大片段缺失g.8091T-22145Cdel突变；Yang等研究证实，SLC26A4基因的启动子突变以及转录因子FOXI1和内向整流钾例子通道KCNJ10均能以SLC26A4/FOXI1或SLC26A4/KCNJ10双基因杂合突变形式导致EVA耳聋的发生[15,16]。本研究未能对SLC26A4基因启动子、大片段缺失以及FOXI1、KCNJ10基因进行检测，但之前研究提示中国汉族人群上述基因突变率很低[17]。尽管如此，对于未能检测出SLC26A4双等位基因突变的EVA患者仍需考虑这些基因致病的可能性，同时也有必要进一步探索与EVA相关的其他未知致病基因。

综上所述，本研究通过对华东地区135例非综合征性EVA耳聋先证者SLC26A4基因筛查证实SLC26A4基因的热点突变方式为c.919-2A＞G和p.H723R，对临床EVA耳聋的基因筛查和诊断具有一定参考价值。同时本研究发现EVA耳聋先证者中非SLC26A4双等位基因突变的患者比例较高，并且这部分患者的听力损失程度与SLC26A4双等位基因突变的患者相比没有显著差异，提示可能存在其他致病因子在EVA综合征耳聋的发生发展中起到重要的作用。未来研究需要进一步探索导致EVA的新致病因素，促使建立在基因诊断基础上的遗传咨询和产前诊断更加准确和完善。

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