赖瑞联 陈瑾 冯新

摘  要  橄榄是中国传统的药用植物，其中多酚类物质是橄榄重要的功效成分之一。目前，橄榄多酚类物质研究较为广泛，常用的提取方法包括温浸法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、超声与微波协同辅助提取法等，分离纯化后采用液相色谱或液质联用技术鉴定多酚类物质的种类和成分，并对其抗氧化、抗病毒、抗菌消炎、抗癌抑癌、解酒护肝和提高机体免疫等方面的药理活性进行验证。此外，橄榄多酚类物质合成和代谢分子机理也已经被初步阐释。基于上述研究报道，本文进一步对橄榄多酚类物质后续研究方向和产业化开发利用前景进行展望。

关键词  橄榄;多酚;研究进展;药理活性中图分类号  S667.5      文獻标识码  A

DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.029

橄榄（Canarium album（Lour.） Raeusch.）是我国热带亚热带地区特色名贵果树，也是国家卫计委公布的药食同源作物之一^[1]。中国是橄榄种质资源起源和主要分布中心，福建、广东、广西、云南、海南、台湾和浙江等南部省（区）均有橄榄分布和栽培，此外，越南、缅甸和马来西亚等东南亚国家也有少量橄榄分布^[2-3]。橄榄作为我国南方传统药用果树和重要经济作物，已经融入当地的民俗和文化中，橄榄产业科技创新、种质资源挖掘、功效成分开发利用等也越来越受关注。

我国橄榄种质资源极为丰富，为更好实现种质资源的创新利用，并将资源优势转化为经济优势，除筛选更符合大众口味的鲜食橄榄品种，还需关注橄榄功效成分及其附加产品的创新与开发利用^[4]。研究表明，橄榄具有解酒保肝^[5-6]、抗菌消炎^[7]、提高机体免疫^[8]、抗氧化^[9]、抗癌抑癌^[10-11]、修复关节软骨^[12]等药理活性。而橄榄的功效成分种类和含量丰富，主要包括精油^[13]、类黄酮^[14-15]、多糖^[9]、多酚^[16]、矿质元素^[17]、萜类物质^[6]及氨基酸^[18]等，其组成成分和分子结构均有相关报道。其中，多酚类物质是橄榄最重要且含量最高的功效成分，也是影响橄榄鲜食品质的核心指标之一^[19-22]。目前，橄榄多酚类物质研究也取得了较大进展^[23-25]。本文主要从提取分离、纯化鉴定、药理活性及分子生物学等几个方面对国内外橄榄多酚类物质研究概况展开综述，并对橄榄多酚类物质后续研究方向和产业化开发利用前景进行展望。

1  橄榄多酚类物质的提取分离

多酚类物质是来源于莽草酸途径与苯丙氨酸途径的一类具有芳环结构并结合一个或多个羟基的化合物^[26]。由于多酚类物质富含羟基，其通常能溶于水且易溶于甲醇、乙醇和丙酮等极性较大的有机溶剂，而在有氧与高温条件下易被氧化为醌^[27]。因此，橄榄多酚类物质提取时大多使用水、乙醇或丙酮溶液作为提取液，且提取温度通常介于20～72 ℃。根据浸提过程中辅助手段不同，橄榄多酚类物质提取方法大致分为5类，见图1。提取橄榄多酚类物质后，通常采用酒石酸铁法、福林酚试剂法和紫外分光光度计法进行含量测定。向丽等^[28]初步建立了基于福林酚比色法橄榄多酚类物质测定体系：酚试剂1.5 mL、10% Na₂CO₃6 mL，于30 ℃下反应60 min，置于765 nm波长下测定。而谢倩等^[29]对酒石酸铁法、福林酚试剂法和紫外分光光度计法进行比较，结果发现3种方法均具有良好的重复性，其中紫外分光光度计法操作简便且成本不高，可作为橄榄多酚类物质测定的理想方法。

图1橄榄多酚类物质的提取过程

Fig. 1  Extraction process of polyphenols inC. album

1.1 温浸法

温浸法是指在利用水或乙醇溶液作为溶剂提取橄榄多酚类物质时，通过水浴等方法为提取体系提供一定的温度，从而促进提取液与物料接触的一种提取方法。这种方法的优点在于操作简单且不需要复杂的设备，但提取时间较长。影响温浸法提取橄榄多酚类物质效果的关键因素包括提取温度、溶剂的种类与浓度、提取时间、料液比等（表1）。综合提取效果与操作过程的便捷程度，适合橄榄果肉多酚类物质提取的温浸法提取工艺为：去核果实干燥粉末以1∶20的料液比投入60%～70%丙酮水溶液中，在20～30 ℃的环境下搅拌60 min，提取得率可达到16.9%;而橄榄叶片多酚类物质提取的最佳温浸法提取工艺为：烘干叶片粉末以1∶25的比例投入50%的乙醇溶液中，提取3次，提取144 min，其得率约14.7%。此外，采用贤景春等^[30]建立的温浸提取法测定橄榄根中多酚类物质含量为6.015 mg/g，也说明橄榄根中的多酚类物质含量较低。

1.2 超声波辅助提取法

超声波辅助提取法是指将提取体系置于一定频率的超声波环境下，利用超声波的空化效应、热效应及机械作用促进多酚类物质溶解到溶剂中的一种提取方法。这种方法具有提取时间短、效率高等优点，同时避免高温对多酚类物质的破坏，但提取噪音大，并且当提取量较多时，需较大的设备提供充分功率的超声波。超声波辅助提取法影响因素较多，包括溶剂的种类与浓度、超声波功率、提取时间和料液比等（表2）。经过多次优化，从提取效果与可操作性上看，适合橄榄果肉多酚类物质提取的超声波辅助法提取工艺为：去核果实干燥粉末以1∶20的料液比投入60%～70%丙酮水溶液中，置于80 W功率的超声环境中提取25 min，其多酚提取率可达到17.8%。而孔佳祥等^[40]的方法提取橄榄叶片总多酚类物质得率约为8.9%。

1.3 微波辅助提取法

微波辅助提法是将提取体系置于一定的微波环境下，利用微波的穿透及内部迅速加热的特性，使橄榄多酚类物质快速转移到提取体系。该方法提取时间短、能耗小且避免了长时间加热对多酚的损耗，但提取操作烦琐，成本较高^[44]。目前，微波辅助提取法在橄榄中的研究和应用较少，何志勇等^[45]通过试验初步筛选了适宜微波辅助提取橄榄多酚类物质的工艺为：在1∶20的料液比中，将橄榄材料投入60%～70%的丙酮水溶液中，在340 W的微波中提取5 s，其多酚提取得率约为18.6%。

1.4 超声与微波协同辅助提取法

超声与微波协同辅助提取法是同时利用超声波与微波的优点，优化最佳体系提取橄榄多酚类物质。目前，超声与微波协同辅助提取法在橄榄中也有不少研究报道。何志勇等^[45]建立了基于超声与微波协同辅助的橄榄多酚类物质提取方法，即橄榄干燥果实粉末按照1∶10～1∶15投入60%～80%乙醇水溶液中，设定超声波功率为50 W，微波功率为100～600 W，提取0.5～3 min。项昭保等^[46]则采用响应面法进行工艺优化，进一步筛选出最适体系：橄榄干燥果实粉末按照1∶30投入62%乙醇水溶液中，设定超声波功率330 W，微波功率550 W，提取4.4 min，使橄榄多酚类物质提取效率大幅度提高。

1.5 亚临界水提法

亚临界水提法是指在一定的压力下，以温度处于100 ℃至临界温度范围的亚临界水为溶剂，进行橄榄多酚类物质提取的一种方法。这种方法不需使用有机溶剂，更为环保，但提取时需要使用密闭的提取设备，压力与体积的乘积一般会超过3 MPa/L，具有一定的危险性，且操作程序更为烦琐^[47]。目前已知的橄榄多酚类物质亚临界水提法具体提取工艺为：将果肉干燥粉1∶20～1∶30的料液比投入萃取釜中，设定压力为5～10 MPa，温度为200～270 ℃，提取时间为20～60 min^[48]。

2  橄榄多酚类物质的纯化鉴定与化学结构分析

2.1 橄榄多酚类物质的纯化与鉴定

橄榄多酚类物质的纯化与鉴定根据目的可分为两类，一类是将橄榄提取液初步除杂纯化获得粗提物，然后采用液相色谱的方法鉴定提取物中已知的多酚类物质;另一类是通过固液分离-萃取分相-柱层析梯度洗脱从而获得橄榄多酚，然后通过液相与质谱联用技术对橄榄多酚的种类和成分进行鉴定。

2.1.1  果肉多酚类物质纯化与鉴定  目前已鉴定的橄榄果肉多酚类物质主要包括没食子酸、绿原酸、短叶苏木酚酸、芥子酸、金丝桃苷、穗花杉双黄酮、槲皮素和香豆酸等34种（表3）。此外，何志勇等^[43]还发现了橄榄果肉中另外5种不确定的多酚类物质，其中2种可能互为异构体的鞣花酸，2种6-羟基联苯二甲酸衍生物及1种相对分子质量为348的未知多酚类物质。基于橄榄多酚类物质分离鉴定技术，在橄榄高功效品种筛选时，林玉芳等^[49]采用高效液相色谱法对不同橄榄品种多酚类化合物组分含量进行比较分析，确定了‘马坑22号为高鞣花酸含量品种，‘檀头为高芦丁品种，而‘霞溪本同时富含2种组分。

2.1.2  叶片多酚类物质纯化与鉴定  橄榄叶片多酚类物质纯化与鉴定研究报道相对较少。郑贤民^[38]和王宗举^[56]等通過大孔吸附树脂分离法对橄榄叶片提取液中的多酚类物质进行研究，分别将多酚类物质的纯度提高到了68.52%和71.20%，并通过液相色谱鉴定获得橄榄叶片中没食子酸、槲皮素、穗花杉双黄酮和芦丁等4种多酚类物质。

2.2 橄榄多酚类物质的化学结构分析

根据已有报道，目前鉴定获得橄榄叶片和果肉中34种已知多酚类化合物，采用Integle中的InDraw模块对其化学结构进行查询与绘制，结果见图2。

3  橄榄多酚类物质的药理活性研究

3.1 解酒护肝

橄榄汁液素有解酒保肝的功效。张怡等^[5]通过对酒精性肝损伤的小鼠喂食橄榄汁后发现，橄榄汁及其透析液能够显著降低血清谷丙转氨酶和脂质过氧化物，有效激活全血超氧化物歧化酶和乙醇脱氢酶，而橄榄透析液中包含大量多酚类物质，其中类黄酮物质含量最高，证明橄榄多酚类物质具有解酒保肝药理活性。此外，Ito等^[57]利用橄榄中分离纯化获得的几种多酚类物质，对离体培养的小鼠肝细胞进行抗毒肝素活性试验认为，短叶苏木酚、金丝桃苷、鞣花酸及3，3′-二甲氧基鞣花酸这4种多酚类物质可能在保肝护肝过程中发挥主要作用。

3.2 抗氧化

二苯基苦基苯肼自由基（DPPH·）和铁离子还原/抗氧化能力（FRAP）测定是橄榄多酚自由基清除能力和抗氧化活性鉴定中常用的方法^[32]。研究表明，橄榄多酚类物质具有较强的2，2′-氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）自由基（ABTS⁺·）、DPPH·、羟自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O₂^-·）和亚硝酸盐（NO₂^-）清除能力及铁离子还原能力，可作为天然的食品抗氧化剂^[58-60]。此外，Kuo等^[61]也发现橄榄乙醇水溶液提取物的抗氧化效果和自由基清除能力与提取液中多酚类物质存在量效关系。而在具体抗氧化成分鉴定中，吕镇城^[54]、林鈺郡^[62]和Chang^[63]等研究认为，橄榄多酚类物质的抗氧化主要组分包括槲皮素、山奈酚、鞣花酸、没食子酸、3-O-没食子酸奎宁酸、老鹳草素及异柯里拉京等。此外，利用不同溶剂提取时，80%丙酮溶剂获得的橄榄多酚类物质具有更高的抗氧化活性，而其具体影响因素则有待进一步研究^[64]。

3.3 抗癌抑癌

脂质代谢是人体代谢的重要组成部分，脂类代谢紊乱可能引发机体癌变。Liu等^[10]研究发现，橄榄中的多酚能够激活肝癌细胞中腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路，下调固醇调节元件结合蛋白（SREBP-1）和脂肪酸结合酶（FAS）表达，同时上调过氧化物媒体增殖物活化受体（PPAR-α）表达，从而抑制细胞中脂质过度积累，起到抗癌抑癌的生理功能。此外，向丽等^[11]也通过试验发现，橄榄多酚类物质能够有效抑制人宫颈癌Hela细胞增殖，同时激活caspase-3表达，从而促进癌细胞凋亡，结果进一步说明橄榄多酚

类物质具有抗癌抑癌功能。

3.4 抗病毒

Duan^[8]等研究表明，橄榄果实乙酸乙酯提取物能够抑制人体免疫缺陷病毒（HIV）糖蛋白跨膜单元gp41中介导HIV病毒侵染目标细胞的结构——六螺旋束的形成，并通过进一步鉴定发现没食子酸是提取物中的主要功能成分之一。此外，橄榄多酚类物质能够明显抑制乙肝病毒HBsAg/HBeAg在HepG22细胞中的自我复制，具有抗乙肝病毒的药理活性，且对正常细胞无毒害作用，而发挥这种抗性的组分主要是没食子酸和鞣花酸^[65-66]。

3.5 其他

橄榄多酚类物质在降低血糖、提高机体免疫和抗菌消炎等方面同样具有很好的功效。张润普等^[67]研究发现，喂食橄榄多酚类物质可显著增加大鼠骨密度和骨钙含量。王瑶等^[68]研究表明，橄榄多酚类物质对口腔颌面常见的致病菌也有较好的抑菌作用。此外，橄榄多酚能够抑制机体α葡萄糖苷酶活性及恢复胰岛素分泌，从而抑制糖尿病小鼠血糖升高^[69]。

4  橄榄多酚类物质合成和代谢的分子机理研究

橄榄分子生物学研究起步较晚，其多酚类物质合成和代谢机理报道较少。王云梅^[70]和张庆举^[71]等首先对橄榄叶多酚代谢途径上游基因进行克隆，获得了对-香豆酸辅酶A连接酶C4H、苯丙氨酸解氨酶PAL、肉桂酸-4-羥化酶4CL、黄烷酮- 3-羟化酶F3H、查尔酮异构酶CHI和查尔酮合成酶CHS等基因序列，并通过生物信息学分析初步揭示了橄榄多酚代谢机理。随后，赖瑞联等^[72]开展橄榄CHI基因密码子特征分析，为其基因功能和分子进化研究提供了科学依据。而黄敏杰等^[73]通过qRT-PCR检测发现，橄榄类黄酮3′-羟化酶F3′H基因与多酚类物质在果实发育过程中的变化趋势相符，验证其在多酚合成和代谢中发挥重要调控功能。此外，随着现代高通量测序研究和应用的不断深入，李安玉^[74]以多酚类物质含量差异较大的‘长营和‘清榄橄榄为材料，初步挖掘出橄榄儿茶酚胺氧位甲基转移酶COMT、肉桂醇脱氢酶CAD、过氧化物酶POD、丙二烯氧化环化酶AOC、酪氨酸转氨酶TAT、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶HPPD、黄酮醇合成酶FLS、黄酮3-O-单氧酶F3M和阿魏酸-5-羟基化酶F5H等一系列橄榄多酚代谢关键基因，进一步揭示了橄榄多酚类物质合成和代谢分子机理。

5  展望

5.1 橄榄多酚类物质组分和基础应用研究

大量研究结果表明，橄榄多酚类物质在抗菌消炎、保肝护肝、抗癌抑癌、降低血糖和提高机体免疫等方面具有良好的药理活性，开发应用市场前景广阔。然而，目前橄榄多酚类物质研究和应用还处在初级阶段，对其中发挥具体药理活性的组分研究较浅，许多橄榄多酚结构和种类也并不明确，仍有必要进一步结合质谱和核磁共振技术鉴定结构并加以开发利用，提高橄榄多酚类物质的利用效率。另一方面，橄榄不同品种间多酚含量和种类差异较大，需要加大橄榄种质间多酚类物质基础数据挖掘，为橄榄高功效品种筛选提供参考。此外，橄榄多酚类物质提取分离方法种类多样，在产业开发时关注提取效果的同时，也需要结合食品安全标准，注重提取产物的安全性和规范化，保证橄榄多酚类物质可食性，开发橄榄多酚天然保健食品、天然保鲜剂和抗氧化剂。

5.2 橄榄多酚类物质合成和代谢分子机制阐释

生物体中，数量性状及其特征质量性状的改变起源于基因差异表达。目前，橄榄多酚类物质合成和代谢相关分子机理研究较少，其关键节点基因和代谢调控网络尚不明确，在后续研究中可以结合现代高通量测序技术开展mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA组学研究，橄榄基因组草图构建以及橄榄多酚代谢组学关联分析，进一步阐释橄榄多酚类物质合成和代谢的分子机制。此外，结合SNP等第3代分子标记技术对橄榄多酚类物质合成相关位点进行准确定位，可为橄榄高功效定向育种提供分子辅助技术。

5.3 橄榄多酚类物质药理活性开发

在药理活性研究方面，在橄榄多酚类物质组分分离纯化和结构鉴定的基础上，可采用CAP-e法^[75]（基于红血球细胞抗氧化保护能力，Cell— based antioxidant protection in erythrocytes）、CAA法^[76]（细胞抗氧化活性，Cellular antioxidant activity）等，结合氧化损伤细胞模型法，开展不同结构多酚的抗氧化活性研究，进一步明确橄榄多酚类物质的药理活性。

综合分析，目前橄榄多酚类物质研究和利用水平较低，后续应主要开展以下几个方面研究：一是橄榄多酚的高效制备工艺和稳态化技术开发;二是橄榄多酚种类的分离纯化和结构鉴定;三是橄榄高多酚含量种质筛选与多酚合成机理阐释，四是橄榄多酚的药理活性挖掘，最后进行橄榄多酚相关功能性产品的开发应用。随着这些工作的开展，橄榄多酚类物质的研究与利用体系将更加完善，作为一种新型天然活性物质发挥广阔的市场前景。

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