田万年,李荣权,薛书江,贾立军,张守发

(1.吉林农业科技学院动物科技学院,吉林 吉林 132101;2.延边大学农学院,吉林 延吉 133002)

牛的卵形巴贝斯虫病(Babesia ovata)是由巴贝斯科巴贝斯属的卵形巴贝斯虫寄生于牛红细胞内所引起的寄生虫病。我国于1986年在河南省卢氏县牛体内发现该病,随后1994年,在甘肃张家川回族自治县牛体内分离到卵形巴贝斯虫[1]。目前牛卵形巴贝斯虫病的诊断主要通过血液涂片,显微镜检查为主,隐性感染牛的血液染虫率较低,显微镜检测易出现漏检和误诊。PCR方法是一种快速、敏感、特异的诊断方法,已应用牛卵形巴贝斯虫病的诊断[2-3]。目前对该病不同靶基因进行PCR方法的比较研究尚未见相关报道。因此,本试验根据GenBank已公布的卵形巴贝斯虫AMA-1、CCTη和18S rRNA基因序列分别设计3对引物,从特异性、敏感性和临床样本检出率方面进行对比,为牛卵形巴贝斯虫病的早期诊断及流行病学调查提供快速、敏感的检测方法。

1 材料与方法

1.1 样本来源 血液样本采自吉林省珲春地区散养的延边黄牛60份,无菌采取抗凝血,用PBS洗3次。存于-20℃备用。同时制作了血液涂片,甲醛固定保存,供染色镜检。牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫标准基因组DNA由日本带广畜产大学玄学南教授惠赠。瑟氏泰勒虫基因组DNA由延边大学预防兽医实验室保存。

1.2 主要试剂 全血DNA提取试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DL-2 000 DNA Marker等,均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 引物的设计与合成 根据GenBank上登录的牛卵形巴贝斯虫18S rRNA基因序列(AY081192)、AMA-1基因序列(AB634843)和CCTη基因序列(AB367928),利用Primer Premier 5.0软件设计了3对特异引物(见表1)。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

表1 试验所用引物信息

1.4 牛卵形巴贝斯虫DNA标准模板的制备 按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书操作提取基因组DNA,抽提的DNA用50 μL TE溶解,-20℃保存备用。

1.5 PCR反应条件 以提取的牛卵形巴贝斯虫DNA为模板,以18S rRNA为靶基因PCR反应条件:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,30个循环,最后72℃延伸7 min;以AMA-1为靶基因PCR反应条件:94℃预变性5 min,94℃变性20 s,58℃退火45 s,72℃延伸30 s,30个循环,最后72℃延伸7 min;以CCTη为靶基因PCR反应条件:94℃预变性5 min,94℃变性20 s,60℃退火30 s,72℃延伸45 s,30个循环,最后72℃延伸7 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 特异性试验 以卵形巴贝斯虫基因组DNA为试验样本,以牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和瑟氏泰勒虫基因组DNA为对照样本。分别应用3对引物进行PCR扩增,分析其特异性。

1.7 敏感性试验 用紫外分光光度计测定已提取的卵形巴贝斯虫DNA的D260nm值,计算DNA含量。以10倍为梯度进行稀释成7个不同浓度,进行PCR扩增,对比其敏感性。

1.8 临床样本的检测试验 应用3对引物对采自吉林省珲春地区的60份血液样品进行PCR检测。比较3种靶基因PCR方法的阳性检出率。同时,与血液涂片镜检相对比。

2 结果

2.1 基因组DNA浓度 将提取的牛卵形巴贝斯虫基因组DNA经紫外分光光度仪测定其D260nm值,DNA 含量为16 ng/μL。

2.2 特异性试验 将以牛卵形巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和瑟氏泰勒虫基因组DNA为模板,分别用3对引物进行PCR扩增,PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析。电泳结果显示,仅牛卵形巴贝斯虫DNA样本扩增后出现特异性DNA条带,而牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和瑟氏泰勒虫均无此扩增条带出现(见图1)。

图1 特异性试验结果

2.3 敏感性试验 取提取的牛卵形巴贝斯虫DNA按10倍倍比稀释后,分别用不同靶基因引物进行PCR扩增,反应结果进行琼脂糖凝胶电泳检测(见图2)。以18S rRNA靶基因的PCR敏感性最高,最小检测 DNA含量为16 fg/μL;以 CCTη靶基因的PCR敏感性最低,最小检测DNA含量为1.6 pg/μL;而以AMA-1靶基因的PCR敏感性最高,最小检测DNA含量为1.6 fg/μL。

图2 敏感性试验结果

2.4 临床样本检测 对采自吉林省珲春地区60份血液样本分别用3对引物进行PCR扩增。以18S rRNA基因设计引物的阳性率为30%(18/60),以AMA-1基因设计引物的阳性率为25%(15/60),以CCTη基因设计引物的阳性率为21.67%(13/60),且血液涂片镜检诊断为阳性的样本经PCR诊断均为阳性。

表2 临床样本检测结果

3 讨论

牛卵形巴贝斯虫病主要表现为高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿,对牛危害较大,严重制约养牛业发展。因此,对该病进行早期准确诊断是有效控制其蔓延的重要手段。目前,在所建立的牛卵形巴贝斯虫病的诊断方法中,PCR方法具有特异性强、敏感性高的优点是目前该病临床诊断和流行病学调查的主要方法[4-5]。不同基因其开放阅读框的稳定性不同,其敏感性、特异性会受到影响[6]。因此筛选出牛卵形巴贝斯虫病特异、敏感的PCR诊断方法是十分必要的。

18S rRNA为核糖体小亚基的DNA序列,该基因在不同虫种间变异较大,在同种间具有较好的保守性,已广泛应用于病原的分类、鉴定的靶序列[7-8]。顶膜抗原1(AMA-1)最早在诺氏疟原虫中被鉴定出来,在疟原虫侵染宿主细胞中被认为是不可或缺的抗原蛋白,AMA-1是虫体入侵红细胞之前以膜结合形式分泌到虫体表面蛋白[9]。含t-复合多肽1(TCP-1)的伴侣素(Chaperonin)简称为CCT,CCT又称Tric(TCP-1 ring complex)分子伴侣系统属于分子伴侣素家族,CCTη是CCT的一个亚基,存在于细胞浆中异型寡聚蛋白[10]。黄国明等[1]对牛卵形巴贝斯虫伴侣素CCTη基因进行了克隆与生物信息学分析。本试验根据Gen-Bank上登录的牛卵形巴贝斯虫18S rRNA、AMA-1和CCTη基因序列设计3对引物,分别进行PCR扩增,从特异性、敏感性和临床样本检出率方面比较。结果表明,18S rRNA的PCR方法敏感性最高,比AMA-1基因敏感10倍,比CCTη基因敏感100倍。临床样本检测表明,以18S rRNA为靶基因设计引物PCR检出率最高,阳性率为30%(18/60)。本试验通过对卵形巴贝斯虫不同靶基因的PCR检测比较,筛选出以18S rRNA基因PCR方法的敏感性和临床样本检出率最高,为牛卵形巴贝斯虫病的早期诊断和流行病学调查提供了有效方法。

参考文献:

[1] 巴音查汗,五十岚郁男.牛卵形巴贝斯虫的体外培养[J].中国兽医寄生虫病,2001,9(2):15-17.

[2] Sivakumart,Tagawa M,Yoshinari T,et al.PCR detection of Babesia ovata from cattle reared in Japan and clinical significance of infection withTheileria orientalis[J].J Clin Microbiol,2012,50(6):2 111-2 113.

[3] 黄国明,贾立军,薛书江,等.牛卵形巴贝斯虫巢式PCR诊断方法的建立及初步应用[J].中国兽医学报,2012,32(10):1 484-1 487.

[4] 王轶男,钱年超,黄国明,等.牛瑟氏泰勒虫与牛卵形巴贝斯虫多重PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学,2013,43(4):412-415.

[5] 黄国明,贾立军,薛书江,等.牛卵形巴贝斯虫PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国预防兽医学报,2012,34(8):651-654.

[6] 金超,贾立军,王妍,等.牛瑟氏泰勒虫不同靶基因PCR检测方法的比较[J].畜牧与兽医,2011,43(2):1-3.

[7] 龚真莉,刘光远.马属动物梨形虫病的PCR鉴别诊断方法研究[J].中国动物检疫,2014,31(5):74-77.

[8] 罗建勋,殷宏,刘光远,等.牛的巴贝斯虫18S rRNA基因序列比较研究[J].畜牧兽医学报,2005,36(9):906-911.

[9] 范丽哲.东方巴贝斯虫3个免疫相关基因的克隆表达[D].武汉:华中农业大学,2014.

[10] 常晓燕,陈杰.伴侣素CCT的结构及与肌动蛋白、微管蛋白的作用机制[J].国外医学生理、病理科学与临床分册,2003,23(6):596-598.