白艳凤

组蛋白甲基化转移酶(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)又称为果蝇zeste基因增强子同源物2，是多梳基因家族的重要一员，与细胞的分化、增殖等关系密切，在胚胎的早期发育中普遍存在[1-2]。越来越多的研究表明EZH2的表达水平与恶性肿瘤如乳腺癌、肝癌、卵巢癌等密切相关，但与其化疗耐药的相关性报道较少[3]。本文为分析探讨EZH2与卵巢癌合并肺部感染患者化疗铂类耐药的相关性及其机制，特进行了相关研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

本次实验所用的人卵巢癌细胞系A2780及其铂类耐药细胞系A2780/DDP均由中南大学湘雅三医院临床药理实验室保存。主要试剂来源：PCR引物由上海英骏生物合成，Trizol试剂从美国Invitrogen公司进口，逆转录酶试剂盒及PCR反应液由日本Toyobo公司进口，荧光标志物从北京中杉试剂公司购买，山羊血清及β-actin抗体(BM0627)从武汉boster公司购买，BCA蛋白测定试剂盒、IP和Western细胞裂解液均从碧云天公司购买，EZH2抗体(ab3748)由美国ABCAM公司进口，LumiGLO发光物购于深圳晶美公司，酶标记物IgG(H+L)由美国Pierce公司进口。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 培养箱设定温度为37 ℃、相对湿度为90%、CO2为5%，A2780采用DMEM完全培养基(含10%的胎牛血清)贴壁生长；A2780/DDP培养箱设定条件同前，不同的是在两代培养液中加入浓度为5 μmol/L的顺铂来维持耐药性。

1.2.2 RT-PCR检测EZH2mRNA及蛋白表达 提取各细胞的总RNA，并根据反转录说明书将其反转为cDNA，应用ABI 7300PCR定量仪行PCR反应。EZH2内参为GAPDH，下游引物为5-TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC-3,上游引物为5-TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC-3;设定PCR无模版阴性对照，在试验完成后作熔解曲线进行分析以判断产物是不是单一。重复本次试验3次。

1.2.3 Western检测EZH2 mRNA及蛋白表达 将各细胞收集后应用RIPA裂解法提取各细胞总蛋白，并应用BCA法对蛋白质浓度进行测定。提取50 μg的总蛋白进行分离并用硝酸纤维素膜封闭，加入β-actin单克隆抗体和EZH2单克隆抗体以500∶1的比例稀释后加入二抗，1 h后用电化学进行发光显色。灰度分析应用Quantity One 电脑软件进行分析，重复本次试验3次。

1.2.4 免疫荧光法检测EZH2 mRNA及蛋白表达 将收集的细胞数调整到24孔板内，并置于相对湿度为90%、CO2为5%、温度为37 ℃的培养箱中进行培养，选取适宜细胞行实验，先应用PBS进行洗涤，应用4%的多聚甲醛进行固定，时间为15 min，并用山羊血清进行1 h封闭，封闭后加入EZH2抗体在培养箱中培育2 h，并在避光条件下加入荧光二抗继续避光培育2 h，将显微镜倒置照相。重复本次试验3次。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 RT-PCR检测EZH2mRNA及蛋白表达

经PT-PCR检测,EZH2 mRNA和蛋白在A2780细胞中的表达水平分别为(0.68±0.19)、(0.10±0.02)，而在A2780/DDP细胞中的表达水平分别为(1.12±0.21)、(0.22±0.10)，两者差异均有统计学意义，见表1。

表1 RT-PCR检测EZH2 mRNA及蛋白表达结果

2.2 Western检测EZH2 mRNA及蛋白表达

经Western检测,EZH2 mRNA和蛋白在A2780细胞中的表达水平分别为(0.67±0.16)、(0.11±0.04)，而在A2780/DDP细胞中的表达水平分别为(1.20±0.212)、(0.24±0.12)，两者差异有统计学意义，如表2所示。

表2 Western检测EZH2 mRNA及蛋白表达结果

2.3 免疫荧光法检测EZH2 mRNA及蛋白表达

经过免疫荧光法检测,EZH2 mRNA和蛋白在A2780细胞中的表达水平分别为(0.71±0.13)、(0.14±0.11)，而在A2780/DDP细胞中的表达水平分别为(1.31±0.34)、(0.28±0.15)，两者差异有统计学意义，如表3所示。

表3 Western检测EZH2 mRNA及蛋白表达结果

由此可见，3种试验方法均表明EZH2蛋白在A2780及A2780/DDP中的表达主要以核表达为主，且A2780/DDP的表达明显高于A2780，两者差异有统计学意义(P<0.05)；EZH2 mRNA的表达在A2789/DDP中较A2780增加更为显著(P<0.05)。

3 讨论

卵巢癌是目前妇女常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着患者的生活质量和生命安全[4]。目前对于卵巢癌临床主要以手术治疗为主，并进行辅助化疗，辅助化疗虽可提高患者的总体反应率和生存率[5]，但同时也带来了多种耐药现象而影响治疗，因此，寻找一种逆转耐药以提高化疗药物敏感度的基因已经成为了肿瘤患者及专家们的关注焦点[6-7]。EZH2持续激活可引起细胞的异常恶化增殖，因此被当成是一种癌候选基因，且多种恶性肿瘤如乳腺癌、前列腺癌及肝细胞癌等均被证实其EZH2表达水平增高[8]。有研究表明[9-10]EZH2基因的表达与化疗铂类耐药性存在一定的相关性，它可特异性的通过位点将组蛋白上赖氨酸(位于27位，H3-K27)甲基化从而沉默抑癌基因转录及改变染色质的构象，使得癌细胞增殖并抑制凋亡。

本次研究为分析探讨组蛋白甲基化转移酶与卵巢癌合并肺部感染患者化疗铂类耐药的相关性及其机制，进一步为临床诊治卵巢癌合并肺部感染患者提供相关的理论指导与依据，对人卵巢上皮性癌细胞株A2780、铂类耐药细胞株A2780/DDP分别采用免疫荧光法、RT-PCR及Western blot方法检查其EZH2 蛋白及mRNA表达的水平差异，探讨EZH2对上皮性癌细胞株A2780和铂类耐药细胞株A2780/DDP表达水平的差异性。结果发现3种试验方法均表明EZH2(组蛋白甲基化转移酶)蛋白在A2780及A2780/DDP中的表达主要以核表达为主，且A2780/DDP的表达明显高于A2780，两者比较差异性显著，有统计学意义(P<0.05)；EZH2 mRNA的表达在A2789/DDP中较A2780增加更为显著，两者比较，有统计学意义(P<0.05)。本研究显示了EZH2(组蛋白甲基化转移酶)mRNA及蛋白在卵巢癌细胞A2780和耐顺铂细胞A2780/DDP中的表达水平的差异性，表明了EZH2与卵巢癌患者铂类耐药具有一定的相关性，但其具体作用机制是通过协同DNA阻断细胞凋亡引起耐药还是通过甲基化使癌细胞对顺铂产生耐药作用尚无法确定，还有待进一步的分析研究[11-12]。

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