周 薏 傅志泉 朱 樑

肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌中病死率最高的1种，在肿瘤相关死亡中仅次于肺癌。

肿瘤转移基因(metastasis associated gene,MTA)家族是一类重要的基因转录调节的抑制因子，主要包括MTA1、MTA2、MTA3及一些类似分子，其主要功能为参与组蛋白去乙酰基酶(nucleosome remodeling deacetylase，NuRD)复合物的合成，并且可以通过调节雌激素通路、细胞骨架和细胞凋亡等途径促进肿瘤的侵袭和转移[1]。目前研究发现，MTA家族在高转移乳腺癌、肺癌、肝癌等癌症组织中均有表达[2-6]，且与这些肿瘤的侵袭性、转移以及预后密切相关 。其中MTA3被报道在不同肿瘤中表达不同从而发挥着重要的作用[7-10]。

本研究发现MTA3在肝细胞癌组织中表达上升，在不同肝癌细胞株中的表达也显著上调。应用siRNA干扰技术进一步探讨干扰 MTA3的表达对肝癌细胞增殖的影响。本实验一方面揭示了MTA3的调控机制，另外一方面为后期MTA3是否可能作为一个潜在的肝细胞癌治疗基因靶点提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 标本获取、细胞株和主要试剂

20份肝细胞癌和癌旁样本取自上海市长征医院普外科行手术切除并经病理确诊的肝癌患者。所有患者术前均未接受放化疗，临床病理资料和随访记录完整。收集患者术后肝癌组织和相应癌旁非癌组织(距癌组织边缘≥5 cm)标本。研究方案经上海市长征医院伦理委员会批准，患者或其家属签署知情同意书。

人正常肝细胞株L02和人肝癌细胞株HepG2、Huh7、Hep3B(上海吉满生物科技有限公司)。

MTA3兔抗人单克隆抗体(购自英国Abcam公司)； Cell Counting Kit-8试剂盒(Sigma-Aldrich Co.)； MTA3 siRNA及阴性对照由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。

1.2 实验方法

1.2.1 实时定量PCR 细胞提取总RNA后，反转录成cDNA，使用SYBR Green法，进行Real-time PCR扩增，总体积20 μl。扩增过程如下：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s，40个循环。β-actin作为内参。基因相对表达水平计算方式如下：ΔCt=Ctgene-Ctreference，增加倍数用 2-ΔΔCt方法计算。每次试验均做3个重复孔。

1.2.2 免疫组织化学 采用免疫组化EnVision二步法检测肝细胞癌组织和相应癌旁非癌组织中 MTA3的表达和分布。石蜡包埋组织5 μm厚度连续切片，脱蜡和水化；切片入0.01 mol/L柠檬酸缓冲液(pH=6.0)，于微波炉内抗原修复20 min，室温冷却后PBS漂洗；3 % H2O2封闭10 min，PBS漂洗；加入MTA3兔抗人单克隆抗体(1∶150)4 ℃过夜；PBS漂洗，滴加二抗，37 ℃ 孵育1 h；PBS漂洗，DAB显色，自来水洗涤，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.2.3 细胞培养 人正常肝细胞株L02和人肝癌细胞株HepG2、Huh7、Hep3B培养于含10%FBS的DMEM培养基中。

1.2.4 siRNA干扰效率检测 siRNA序列如下：siRNA-1:5’-CAGUGUAGAUUAUGUGCAATT-3’；siRNA-2:5’-AGAUAAGCAUGCUAAAGAATT-3’。分别将其转染HepG2，Huh7，Hep3B细胞，48 h收细胞提取RNA用于定量PCR检测MTA3表达确定干扰效率。

1.2.5 CCK-8实验 取对数生长期HepG2和Huh7细胞以2×103/孔接种于96孔板，培养至对数生长期时，以无血清培养基清洗细胞一次，每孔先加入无血清培养基100 μL，再分别转染MTA3 siRNA或对照siRNA，轻摇混匀后于培养箱中静置6 h，弃上清，加入含10% FBS的培养基培养24 h、48 h、72 h，用CCK-8试剂盒进行细胞增殖检测，最终测定OD450。

1.2.6 克隆形成实验 取对数生长期HepG2和Huh7细胞以3×103/皿接种于3.5 cm的细胞皿中，37 ℃，CO2温育两周，1%结晶紫染色后计集落数。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 MTA3在肝细胞癌和癌旁组织、及肝癌细胞株中的表达情况

定量PCR检测结果显示：肝细胞癌组织中的MTA3表达明显高于癌旁组织，P<0.01(图1A)。免疫组织化学结果显示：MTA3在肝细胞癌组织中的表达水平也是明显升高的。除此之外，通过定量PCR检测正常人肝细胞株L02和人肝癌细胞株HepG2、Huh7、Hep3B中MTA3的表达情况，发现除了Hep3B中MTA3的表达相对于正常组无显著差异，其余两组(HepG2、Huh7)中MTA3的表达水平相对于正常组显著升高，P<0.01(图1B)。

2.2 siRNA干预MTA3表达效果检测

构建两个MTA3的干扰siRNA-1/2，分别转染HepG2细胞之后通过定量PCR检测其对MTA3表达的抑制效果，发现两个siRNA干扰组相比于对照组都具有显著差异，P<0.01，说明干扰siRNA构建成功，干扰效率均在50 %左右(图2)。

2.3 干扰MTA3后肝癌细胞株增殖情况

肝癌细胞株HepG2和Huh7中通过siRNA-1/2干扰MTA3之后发现相比于未转染对照组，干扰MTA3后细胞增殖减慢，转染72小时后，OD450吸光值的变化(图3A、B)。除此之外，克隆形成实验检测HepG2和Huh7细胞在干扰MTA3后克隆形成数量显著减少，说明细胞增殖受到显著抑制(图3C、D)。

3 讨论

MTA3作为一类肿瘤转移基因，在不同肿瘤中发挥着不同的作用，之前的研究结果显示MTA3在乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌中低表达[7,11-15]，在子宫非内膜样腺癌中MTA3可以作为一个独立的不良预后指标；MTA3在肺癌组织中高表达，且与不良预后相关，同时MTA3能够促进肺癌细胞的增殖、还能通过调控凋亡蛋白的表达来抑制肺瘤细胞的凋亡[10,16-18]。MTA在HCC组织中的表达情况根据onco mine数据库提供的数据，共有2个研究数据包含MTA3的表达情况：2007年Hepatology发表的35例HCC和10例正常肝组织的MTA表达对比；2002年Mol Biol Cell发表的103例HCC和75例正常肝组织的MTA表达对比，综合两个研究结果，相比于正常肝组织，MTA3在138例HCC中表达显著上调，P<0.05[19-20]。我们在oncomine数据库中检索到的这两个相关研究指出，MTA3在肝细胞癌中高表达，可能参与了肝细胞癌的发生发展，将来可能作为1个潜在的肝细胞癌药物治疗靶点。

图1 MTA3在肝癌、癌旁组织及肝癌细胞株中的表达情况

图2 siRNA干预MTA3表达效果

图3 干扰MTA3后显著抑制人肝癌细胞株增殖

纳入的肝细胞癌临床样本检测显示MTA3在肝细胞癌组织中表达显著上升，这和数据库中检索到的资料结果相符合。之后我们检测了MTA3在各种人肝癌细胞株中的表达，发现相对于人正常肝细胞株，MTA3的表达显著上升，说明在肝细胞癌变的过程中MTA3的表达是上升的，接下来我们构建了两个siRNA成功干扰了MTA3在人肝癌细胞株中的表达，发现下调MTA3的表达能够显著抑制人肝癌细胞株的增殖，这可能说明MTA3在肝细胞癌的发生发展中起到重要的作用，并且很有可能成为潜在的药物治疗靶点。我们的研究一方面揭示了MTA3在肝细胞癌中的表达情况，另一方面初步探讨了其在肝癌细胞增殖过程中的调控作用，为后期的研究提供了基础。

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