王泽盛 田洪磊，王鹏，张芳，未志胜

（1.石河子大学食品学院，新疆石河子832000；2.新疆应用职业技术学院，新疆奎屯833200）

马奶酒（koumiss），又称为马酪、马酒等，是一种自汉朝起就有记载的中国传统发酵型乳酒[1]。传统马奶酒是新鲜马奶加入发酵剂发酵数日后，形成的一种具有马奶独特香味及浓郁酒香的乳白色发酵型饮料，后经过蒸馏成为透明清亮的酒类饮料。目前我国马奶酒的主要产地为新疆及内蒙古，消费群体主要是当地少数民族，如柯尔克孜族、哈萨克族、图瓦人、蒙古族等[2]。马奶酒中富含钙、铁、维生素C、维生素B5、叶酸等，长期饮用马奶酒可以有效的防止血栓、血管硬化、高血压等现代常见慢性病，同时马奶酒的酒精含量低，口感独特，使马奶酒成为新一代的发酵型健康饮品[3]。

近年来，国内外研究学者将研究重点集中在对益生菌群分析，发酵工艺优化及安全性评估等方面，Danova等[4]对酸马奶酒中乳酸菌群进行了分离与鉴定；李少英等[5]对马奶酒中乳酸菌的生物学特性进行了深入研究：王璐等[6]采用响应面法对马奶酒发酵条件进行了优化。然而采用气质联用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）技术对马奶酒中挥发性物质的鉴定及新疆不同地区马奶酒的挥发性物质差异对比现鲜有报道。采用顶空固相微物萃取技术（headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）结合GC-MS分析能够高效、全面的对马奶酒中的醇类、酯类、有机酸类等挥发性物质进行分离鉴定[7]。同时采用相关性分析方法对新疆不同地区马奶酒中的挥发性物质进行分析，找出不同地区马奶酒中共有的挥发性物质，以期能够得出马奶酒中关键的“香气”物质。

本研究采用HS-SPME/GC-MS技术对新疆不同地区马奶酒中的挥发性物质进行分离鉴定，以期能够深入研究马奶酒的挥发性物质的主要构成和明晰造成不同地区马奶酒发酵风味差异产生的原因，同时为规范产业化生产马奶酒奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

分别从新疆阿尔泰布尔津县（1号），新疆塔城额敏县（2号），新疆伊犁昭苏县（3号），新疆伊犁新源县（4号），新疆巴音郭楞蒙古自治州（5号），新疆克孜勒苏柯尔克孜自治州（6号），新疆哈密市（7号），新疆喀什地区塔县（8号）采购马奶酒作为实验样品，编号依次为1～8号（详见表1）。内标2-辛醇（内标浓度为100 ppm），美国Sigma公司，色谱纯。

SPME萃取装置（配有SPME手动进样手柄、75 μm CAR/PDMS/DVB纤维头）：美国Sigma公司；GC-MS（5977 A-7890B）气相色谱质谱联用仪：美国安捷伦公司。

表1 新疆不同地区马奶酒采集详细信息Table 1 Information about the 8 koumiss from different areas from Xinjiang

1.2 试验方法

1.2.1 马奶酒样品预处理

为确保不同样品马奶酒中挥发性物质的稳定性，将采购回的马奶酒冷藏于4℃待用，检测前将马奶酒放置于室温，待其温度恢复至室温（约25℃），再进行检测。

1.2.2 HS-SPME萃取

萃取头老化：将萃取纤维头（75 μm CAR/PDMS/DVB）在GC-MS进样口于250℃老化15 min。

取5mL马奶酒样品于15mL顶空瓶内，加入10μL 2-辛醇作为内标物，顶空瓶至于顶空固相微物萃取器水浴平台上，将萃取针插入顶空瓶，在45℃下吸附30 min。吸附后，迅速插入250℃进样口热解析7 min，同时启动气相色谱-质谱仪采集数据。

1.2.3 GC-MS测定条件

色谱条件：色谱柱为HP-INNOWAX毛细管柱（30 m×250μm，0.25μm）；升温程序：初始温度为40℃，保持5min，以7℃/min的速率升温至150℃，保持5min，后以7℃/min的速率升温至230℃，保持5 min，进样口温度为250℃。载气为氦气，流速为1 mL/min，不分流进样，接口温度为250℃。

质谱条件：EI电离源；电子能量为70 eV；灯丝电流为80 μA；离子源温度为230℃：四级杆150℃。无溶剂延迟，scan标准扫描范围（35 m/z～750 m/z）。

1.3 数据处理

定量分析：为准确定量，选取2-辛醇为内标（10μL，内标浓度），根据检出峰面积大小与其质量大小等比例得出每种待检测物质的含量，从而得出相应物质的质量浓度[8]。计算公式为：

式中：M1为内标的含量，μg/mL；M2为目标物的含量，μg/mL；R1、R2分别为内标与目标物的峰面积。

定性分析：分离出的未知物与NIST’14 library相匹配（仅选取匹配度大于80的鉴定结果）。

2 结果与讨论

2.1 马奶酒挥发性物质分析

对新疆不同地区传统马奶酒中的挥发性物质进行分离鉴定，所得的质谱总离子流色谱图如图1所示。

采用HS-SPME-GC-MS技术，检测出马奶酒中挥发性物质共38种，共确定了31种挥发性物质。由图1可以看出不同地区马奶酒样品的色谱峰峰型在同一丰度下挥发性物质种类丰富且整体具有相似性[9]，说明不同地区的马奶酒虽然在加工工艺上有一定差异，但由于原料相同，使得最终发酵而成的马奶酒在香气属性上相似。同时在确定不同地区马奶酒具有相似性的情况下，可以通过挥发性物质对比，得出共有物质从而确定马奶酒中关键挥发性物质组成。

采用内标法定量，结合质谱定性按出峰时间由低至高排列，最终不同样品中挥发性物质的GC-MS鉴定结果见表2。

图1 新疆不同地区传统马奶酒挥发性物质分析总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of volatile compounds in koumiss form different areas in Xinjiang

表2 不同样品中挥发性物质的GC-MS鉴定结果Table 2 Analytical results for GC-MS identification of volatiles in different samples

从所收集的8个不同地区马奶酒样品中共检测出31中挥发性物质，其中包括10种酯类，7种酸类，6种醛类，4种烃类，3种醇类，1种酮类（表2）。其中7种物质为8种新疆不同地区传统马奶酒所共有，分别是异戊醇、己酸乙酯、壬醛、辛酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸、癸酸。虽然不同地区马奶酒挥发性物质种类组成相似，但是每种挥发性物质的相对组成含量却具有明显的差异。在通过内标法（详见1.3）确定每种挥发性物质含量后计算其相对含量，以期能够直观的体现出每种挥发性物质的含量在其整体挥发性物质构成中所占比例。不同地区马奶酒的挥发性物质种类从10～20种不等，种类最多的为1号阿尔泰布尔津县的图瓦人马场自酿的马奶酒，种类含量最少的为4号伊犁新源县市场采购的农家自酿马奶酒。马奶酒所含挥发性物质种类不同直观的体现为：1号的整体酒味更加丰富，而4号的奶酒香味略显单一整体香味不够浓郁。根据表1数据通过AVNOA单因素方差分析[10]，采用Duncan多重比较得出不同地区马奶酒中按物质大类的各物质成分总含量，详见表3。

续表2 不同样品中挥发性物质的GC-MS鉴定结果Continue table 2 Analytical results for GC-MS identification of volatiles in different samples

表3 新疆不同地区马奶酒挥发性物质的总含量Table 3 The total contents of different groups of volatile compounds identified from koumiss samples from different areas in Xinjiang

由表3可以看出，新疆不同地区的马奶酒样品种挥发性物质主要是由酯类和酸类构成，两类挥发性物质相对含量较高，占各地区马奶酒挥发性物质总量的86.04%～97.40%，平均百分比为90.98%，酯类和酸类是马奶酒挥发性物质构成的最主要的两类物质。酯类占各样品挥发性物质总量的48.72%～82.81%，平均百分比67.75%。酯类通常具有香甜，令人感到舒适宜人的香气，多存在水果的挥发性物质构成中，，是各类酒中重要的芳香物质之一[11-12]。结合表2看出，马奶酒中以乙酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯等乙酯类物质居多，同时乙酯类物质种又多以碳个数为10以下的碳链乙酯为主，可能是由于马奶酒种含有大量的乙醇，在乙酰转移酶等多种酶类的共同酶解作用下发生了酯化反应[13]，使得乙酯类含量相对较高。其中含量相对较高的为己酸乙酯和辛酸乙酯，平均含量分别为8.93%和51.15%。酸类物质仅次于酯类物质，占总挥发性物质含量的14.23%～42.09%，平均含量为25.23%。其中出现频次相对较高的酸类物质有己酸、辛酸、癸酸。马奶酒中挥发性酸类物质较高的原因是由于马奶在发酵的过程中酵母菌在发酵过程中会产生大量的酸类物质，同时在采集到的马奶酒样品的感官体验上酸味十分明显[14]，酸类物质易挥发、易被萃取的特点使得马奶酒中挥发性物质检测含量较高。不同地区的马奶酒种酸类物质通过差异性分析，得出1～6号样品差异不显著具有一定相似性，说明了大部分地区的马奶酒酸类物质的含量是具有相似性的。这也符合马奶酒样品感官体现的结果。醛类物质也是马奶酒挥发性物质构成中重要组成部分，占总挥发性物质总量的1.27%～7.12%，平均含量为3.19%，仅次于酸类物质。其中壬醛为8组不同地区马奶酒挥发性物质中的共有物质之一，占总含量的0.92%～4.65%，平均含量为1.93%。醛类物质一般具有较低的风味阈值，其含量的改变亦可对食品风味产生较大的影响[15]。酮类物质在马奶酒中含量较低，仅检测出2-壬酮一种酮类物质，总量占马奶酒种挥发性物质的0%～1.01%。

图2 不同地区马奶酒的聚类分析图Fig.2 Cluster pedigree diagram of volatiles among 8 kinds of koumiss

2.2 不同地区8种马奶酒挥发性物质的聚类分析

图2为在同一度量标准下，按照统平方欧式距离映射后8种不同地区马奶酒样品及其主要类型挥发性成分聚类分析结果。

由图2a可以看出，通过聚类分析可以较好的将新疆不同地区的8种马奶酒进行区分。欧氏距离的归类原则是基于各组样本间相似程度高低，两样本相似性越大，便会在越小的欧氏距离下归为一类[16]。同一度量标准下进行聚类分析，以各马奶酒样本中所有挥发性物质含量作为聚类依据，可以由图2看出8个不同地区的马奶酒可以分成2个类群；第一类群在距离为3的时候4、6、7号样品可以归为一类，说明这3种马奶酒的挥发性物质构成相似性较高[17]；当欧氏距离为9时，2、3、5、8形成第二类群共4个样品。结合表3可以看出这4个地区的马奶酒在差异性分析上也显示的为不显著；当欧氏距离为16时8种不同地区新疆马奶酒最终可归为一类，说明新疆地区的马奶酒虽然有一定差异性，但整体挥发性物质构成上也具有一定相似性，这可能是由于原料的选择、发酵剂的差异、发酵加工方式的不同导致了马奶酒的挥发性物质构成的区别。第一类群中的4、6、7号的挥发性物质构成比例相近，其中酯类物质的比例都在74%以上，但其它类物质的含量相对较低。而第二类群的1、2、3、5、8号马奶酒，酯类物质的含量均低于68%，并且其它挥发性物质如酸、醛、醇类挥发性化合物种类丰富，含量也相对较高，挥发性成分的复杂性可以直接影响马奶酒的整体风味是否醇厚浓郁。从采购方式也可以看出第二类群的样品多采购与牧民家中或是牧场周边，而第一类群的马奶酒采购于市场中，其加工质量可能相较于当地牧民自家酿造略显不足。同时牧民自酿的马奶酒多采用自然发酵，发酵过程可以不外加菌种，或是直接使用预留好的“酵头”直接发酵，而市场购买的马奶酒会采用外加商业菌种的方式进行发酵。同时奶源的品质也直接导致了最终马奶酒的风味品质。因此没有规范的生产工艺直接导致了产品的品质不均一，也使得马奶酒产业难以规范化、工业化。

挥发性物质组成的差异不仅体现在各单一物质的含量差异，大类物质的改变也会对马奶酒的风味构成产生影响，通过对8种样品中的酯类、酸类、醇类、醛类、酮类、烃类进行聚类分析，能够更为直观的得出导致不同地区马奶酒风味差异的关键物质种类。由图2b可知，在标度（欧式距离）为4时所有挥发性物质归为两大类，在距离达到25时所有挥发性物质可归为一类，在同一度量标准下酯类与各大类物质间的欧式距离最大，说明酯类物质的差异性趋势较其它几类物质更为显著[18-19]。造成酯类物质差异性的原因可能是由于奶源的品质如蛋白，脂肪含量的不同使得最终发酵后酒精度的差异，使得酯化反应程度不同最终导致形成的酯类物质含量种类不同。此外马奶原本的香气浓郁度也很大程度上决定了最终马奶酒的整体香味。因此，新疆马奶酒产业需要标准化整个生产过程，从最初的奶源选择，到菌种的筛选以及发酵工艺的优化相结合，再通过现代检测手段精确监测其风味品质，从而达到马奶酒产业化、标准化、规范化。

3 结论

新疆8个不同地区传统马奶酒共检测出31种挥发性物质，其中7种为8个地区马奶酒共有挥发性成分，分别为异戊醇、己酸乙酯、壬醛、辛酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸、癸酸。马奶酒中挥发性成分主要包含酯类、酸类、醛类、醇类、烃类、酮类，其中酯类与酸类物质含量种类最多，其次为醛类和醇类物质。通过对不同地区马奶酒挥发性成分进行聚类分析可以能看出8个不同地区的马奶酒挥发性物质存在显著差异，通过聚类可以分为2个类群，能够客观真实的反映了样品信息的真实性。同时通过对不同大类物质的聚类分析得出造成不同地区马奶酒差异性的关键物质为酯类物质，可能是造成马奶酒样品不同风味的主要因素。通过GC-MS分析得出的马奶酒挥发性物质组成能够为马奶酒工业化提供理论数据，为后期马奶酒品质监测提供了参考，具有一定的实用价值。

参考文献：

[1]张和平,那日苏.蒙古族的马奶酒[J].中国乳品工业,1993(4):165-168

[2]NAMNANSUREN GAN-OD.马奶酒发酵工艺的研究[D].哈尔滨:东北农业大学,2015:1-2

[3]刘洪元,高昆.马奶及酸马奶 (马奶酒)的营养价值和医疗作用[J].中国食物与营养,2003(4):46-47

[4]Danova S,Petrov K,Pavlov P,et al.Isolation and characterization of Lactobacillus,strains involved in koumiss fermentation[J].International Journal of Dairy Technology,2005,58(2):100-105

[5]李少英,乌尼.马奶酒中乳酸菌的分离及其生物学特性的研究[J].内蒙古农业大学学报(自然科学版),2002,23(4):59-66

[6]王璐,李小溪,古丽娜孜,等.响应面法优化马奶酒发酵条件的研究[J].中国酿造,2014,33(2):66-70

[7]王培璇,毛健,李晓钟,等.不同地区黄酒挥发性物质差异性分析[J].食品科学,2014,35(6):83-89

[8]汪立平,徐岩,赵光鳌,等.顶空固相微萃取法快速测定苹果酒中的香味物质[J].无锡轻工大学学报,2003,22(1):1-6

[9]郎召伟,陆震鸣,龚劲松,等.泸型酒蒸馏前后酒醅中挥发性物质的差异性分析[J].食品与发酵工业,2015,41(7):34-37

[10]余宁华,陆震鸣,许伟,等.基于主成分分析的中国发酵食醋有机酸含量差异性分析[J].食品与发酵工业,2010,36(10):144-148

[11]李华,王华,刘拉平,等.爱格丽白葡萄酒香气成分的GC-MS分析[J].中国农业科学,2005,38(6):1250-1254

[12]胡国栋,张晓磊.顶空固相微萃取-气相色谱/质谱分析啤酒微量香味组分的研究[J].食品与发酵工业,2004(2):1-5

[13]ERTEN H,TANGULER H,CAKIROZ H.The effect of pitching rateon fermentation and flavor compounds in high gravity brewing[J].Journal of the Institute of Brewing,2007,113(1):182-189

[14]李星科,李开雄,邹圣东.酸马奶酒[J].中国乳业,2006(7):58-60

[15]杨敏,周围,魏玉梅.桃品种间香气成分的固相微萃取-气质联用分析[J].食品科学,2008,29(5):389-392

[16]Zhu X,Gao Y,Chen Z,et al.Development of a Chromatographic Fingerprint of Tobacco Flavor by Use of GC and GC-MS[J].Chromatographia,2009,69(7/8):735-742

[17]詹萍,田洪磊,李卫国,等.羊肉特征风味指纹图谱的构建[J].现代食品科技,2013,29(10):2522-2527

[18]李新蕊.主成分分析、因子分析、聚类分析的比较与应用[J].山东教育学院学报,2007(6):23-26

[19]刘罗曼,张颖南.因子分析和聚类分析的一个简单应用[J].沈阳师范大学学报(自然科学版),2005(2):130-132