郑满荣，吕晓玲，王建新，王璐瑶，吴亚平，冯健峰

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

沙棘，又叫醋柳、酸刺、黑刺、沙枣，为胡颓子科沙棘属植物，是一种落叶性灌木。主要分布于欧洲，高加索，小亚细亚和中亚，西伯利亚，中国。在西欧，沙棘主要生长在沙滩、沙丘和山坡上。在中亚地区，主要生长在干燥和沙质的地区[1-2]。根据研究报道，沙棘油富含不饱和脂肪酸、维生素、三萜、甾体类化合物及微量元素等206种对人体有益的活性物质，具有抗疲劳、增强机体活力及抗癌等特殊药理性能，并有促进伤口愈合、缓解冠心病和心绞痛等保健功能[3]。市场销售的沙棘油主要有3种：沙棘籽油、沙棘果油和沙棘全果油，由于提取部位的不同，其生物学功能可能存在差异。本研究比较了沙棘籽油、果油和全果油的主要成分及抗氧化活性，为其应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

沙棘籽油、沙棘果油、沙棘全果油：山西五台山沙棘制品有限公司。

棕榈酸、油酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸甲酯化标准品：上海源叶生物科技有限公司；正己烷：色谱纯、其余试剂为国产分析纯。

1.2 仪器

7890A气相色谱仪：美国Aglilent公司；RE-2000旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；数显式电热恒温水浴锅：天津市欧诺仪器仪表有限公司；756PC紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；TDZ5-WS台式低速自动平衡离心机：湖南湘仪实验仪器开发有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 3种沙棘油的理化性质测定

皂化值参照GBT 5534-2008《动植物油脂皂化值的测定》的方法进行测定；过氧化值参照LS/T 6106-2012《动植物油脂过氧化值测定自动滴定分析仪法》的方法进行测定；酸价参照GB 5009.229-2016《食品安全国家标准食品中酸价的测定》进行测定。

1.3.2 3种沙棘油脂肪酸成分分析

1.3.2.1 样品处理方法

取5 g左右的沙棘籽油于三颈烧瓶中，醇油比（95%乙醇∶沙棘果油，mL/g）2∶1及一定量 KOH 置于恒温水浴锅上，开启磁力搅拌，然后于80℃的水浴中回流皂化2 h。皂化结束后，迅速冷却，再加入一定量的水和石油醚萃取两次。萃取液的上层即含有不皂化物的醚层，萃取液的下层即含有脂肪酸钾盐的水层用3 mol/L的HCl酸化至pH值为1，再用一定量的石油醚萃取脂肪酸。溶有脂肪酸的石油醚用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液在旋转蒸发仪上于50℃旋转蒸发掉石油醚，即得游离脂肪酸[4]。

取脂肪酸样品 200 μL（0.15 g～0.18 g），置于 10 mL具塞试管内。移液管量取2 mL 4%（体积比）的硫酸-甲醇溶液加入到具塞试管中，在75℃水浴中加热反应1 h以甲酯化。反应完毕后，加入2 mL正己烷，5 mL超纯水，振荡试管，静置20 min分层。吸取上层清液，以无水Na2SO4干燥，过有机滤膜（0.22 μm）过滤至离心管待测[5]。

1.3.2.2 气相色谱法分析

气相色谱柱：HP-88（100 m×0.25 μm×0.2 μm）；进样口温度：250℃；检测器温度：270℃；流速：1 mL/min；分流比：30∶1；进样量：2 L。

升温程序：

1.3.3 总酚含量测定

1.3.3.1 总酚的提取

参照王艳等[6]的方法，并根据预试验的情况作出修改：将10 mL甲醇与5 g沙棘油混匀，涡旋混匀10 min。甲醇相分离并过滤，沙棘油相以同样的条件重复萃取2次，合并甲醇相待测。

1.3.3.2 标准曲线的绘制

精确称取没食子酸，用4%碳酸钠定容至250 mL容量瓶，使之溶液浓度为0.1 mg/mL。准确量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于 20 mL 有刻度的具塞试管中，加入1 mL Folin-Ciocalteau试剂，充分摇晃，1 min后加入4%碳酸钠溶液定容至20 mL。75℃水浴加热10 min，冷却后，于760 nm下测定吸光度，绘制标准曲线。

1.3.3.3 待测液多酚含量测定

移取多酚提取液0.2 mL于20 mL具塞刻度试管，加入l mL Folin-Ciocalteau试剂，再加入4%碳酸钠溶液并定容至20 mL，摇匀。75℃水浴10 min。冷却后，于760 nm测定吸光度。根据标准曲线，确定其浓度。结果以GAE（mg/g）表示，即多酚含量相当于标准曲线对应毫克数的没食子酸。平行测定3次，以平均值表示总酚含量。

1.3.4 体外抗氧化能力的测定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力

1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）是一种稳定的有机自由基和具有特征的紫红色团吸收峰，当存在自由基清除剂时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其所接受的电子数成定量关系，因而可用分光法进行定量分析。

称取一定量的沙棘油，分别用无水乙醇配成浓度为 2、4、8、16、20 mg/mL 的待测溶液，吸取待测溶液2.0 mL，加入0.2 mmol/L DPPH·乙醇溶液2.0 mL，摇匀，放置30 min。以无水乙醇调零，测定517 nm处的吸光值A样品。同时，测定样品溶液2.0 mL与无水乙醇2.0 mL混合液在517 nm处的吸光度A对照，再测定2.0 mL DPPH·乙醇溶液与2.0 mL无水乙醇在517 nm处的吸光值A空白。平行测定3次，以平均值绘图[7]。以VC为阳性对照，临用前以蒸馏水配制成与沙棘油溶液同等质量浓度的对照液。蒸馏水做空白对照。做3次平行。对DPPH自由基的清除率按下式计算：

1.3.4.2 还原力的测定

采用三氯乙酸法测定。准确称取1.0 g沙棘油，用乙醇定容至100 mL，配置成20 mg/mL的母液备用。将10 mg/mL的沙棘油用乙醇分别稀释成质量浓度为2、4、8、16、20 mg/mL 沙棘油各 1 mL，加入 2.5 mL pH=6.6的磷酸盐缓冲溶液和2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，混合后，于50℃放置20 min，加入2.5 mL质量分数为10%的三氯乙酸溶液，在4 800 r/min条件下离心10 min。取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸馏水和2.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，混匀，静置10 min，在波长700 nm处测定吸光度。以VC为阳性对照，临用前以蒸馏水配制成与沙棘油溶液同等质量浓度的对照液。蒸馏水做空白对照。平行测定3次，以平均值绘图[8]。

1.3.4.3 总抗氧化能力的测定

用95%的乙醇溶解样品，稀释至不同浓度，取各浓度的样品溶液300 μL，然后依次加入1 mL的0.6 mol/L的H2SO4溶液，28 mmol/L的Na3PO4溶液，4 mmol/L的钼酸铵溶液，95℃水浴中反应90 min后，在695 nm下测吸光度值。以VC为阳性对照，临用前以蒸馏水配制成与沙棘油溶液同等质量浓度的对照液。蒸馏水做空白对照。平行测定3次，以平均值绘图[9]。

1.3.4.4 ABTS+自由基清除率的测定

1）ABTS工作液的配制

根据预试验情况将崔同[10]的方法稍加修改。将ABTS溶于乙醇中制备成7 mmol/L的溶液；取5 mL ABTS溶液和88 μL 140 mmol/L的过硫酸钾溶液混合，在室温、避光条件下静置过夜12-16 h以产生ABTS+·，使用前用乙醇稀释，使其在734 nm波长下的吸光度为0.70±0.02，即得到 ABTS 工作液。

2）测定方法

取不同浓度的样品液400 μL，加入ABTS工作液3.6 mL，准确反应1 min后在734 nm下测定吸光度记为A样品，无水乙醇作试剂空白对照，吸光度值记为A对照。以VC为阳性对照，临用前以蒸馏水配制成与沙棘油溶液同等质量浓度的对照液，蒸馏水做空白对照。平行测定3次，以平均值绘图。按式（2）计算清除率。

2 结果与分析

2.1 3种沙棘油理化性质比较

3种沙棘油的理化性质如表1所示。

表1 3种沙棘油的理化性质Table 1 Physical and chemical properties of three kinds of seabuckthorn oil

3种油脂的酸价、皂化值、过氧化值均符合国家食用油相关标准。酸价以沙棘籽油较高，沙棘果油较低：过氧化值以沙棘籽油较低，沙棘果油较高：皂化值以沙棘果油较低，沙棘全果油较高。

2.2 3种沙棘油脂肪酸成分分析

图1中5种脂肪酸分别为亚麻酸、亚油酸、油酸、硬脂酸和棕榈酸的标准品色谱图，各保留时间分别为32.58、30.22、28.33、27.07 min 和 22.75 min。

图1 5种脂肪酸标准品气相色谱图Fig.1 The gas chromatogram of five kinds standard fatty acid

按照1.3.2方法测定3种沙棘油的主要脂肪酸含量，色谱图见图2～图4。由图可知，3种沙棘油中主要有棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸等脂肪酸。其中各脂肪酸含量如表2沙棘油脂肪酸成分所示，沙棘籽油和沙棘全果油的主要脂肪酸为油酸、亚油酸和亚麻酸，而沙棘果油的主要脂肪酸为油酸和亚麻酸。3种沙棘油的饱和脂肪酸的含量相近，分别为11.04%、12.32%、11.31%：3种沙棘油脂肪酸含量的区别主要在于亚油酸和亚麻酸，沙棘籽油含量约为64.52%、沙棘果油含量约为58.02%、沙棘全果油含量约为60.46%，其中以沙棘果油的亚油酸含量最高，以沙棘籽油的亚麻酸含量最高。这与薄海波等[11]的试验结果存在着一定差异，可能是由于沙棘果的产地及品种的不同以及不同的提取条件都对沙棘油的脂肪酸含量有着不同的影响。

图2 沙棘籽油的气相色谱图Fig.2 The gas chromatogram of seabuckthorn seed oil

图3 沙棘果油的气相色谱图Fig.3 The gas chromatogram of seabuckthorn fruit oil

图4 沙棘全果油的气相色谱图Fig.4 The gas chromatogram of Seabuckthorn total fruit oil

表2 沙棘油脂肪酸成分Table 2 Fatty acid composition of sea buckthorn oil%

2.3 3种沙棘油总酚含量比较

2.3.1 没食子酸标准曲线

没食子酸的标准曲线的直线方程见图5。

图5 没食子酸标准曲线Fig.5 Standard curve of gallic acid

根据标准曲线进行计算，可得3种沙棘油的总酚含量，结果如表3所示，沙棘籽油中的总酚含量最多，沙棘果油与沙棘全果油中总酚含量没有明显差异。

表3 3种沙棘油的总酚含量Table 3 Total phenolic content of three kinds of seabuckthorn oil

2.4 3种沙棘油体外抗氧化性质比较

2.4.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力见图6。

由图6可以看出，在所取浓度范围内，3种沙棘油的DPPH自由基清除率均随着浓度的升高而升高，在0～10 mg/mL浓度范围内，三者随浓度增加，清除率增加迅速，在10 mg/mL～20 mg/mL范围内，随着浓度的升高，清除率逐渐趋于平缓，且清除率接近100%，但在相同浓度范围内，VC对DPPH自由基的清除能力没有明显变化，接近100%。DPPH自由基清除试验中沙棘籽油的EC50值为4.09 mg/mL，沙棘果油为4.00 mg/mL，沙棘全果油为4.49 mg/mL。其中，沙棘籽油的实验结果比Hung-Chih Ting等[12]略低，因此，3种沙棘油均有良好的清除DPPH自由基的能力，是一种优良的自由基抑制剂，可以作为一种天然的抗氧化剂。

图6 DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH free radical scavenging activity

2.4.2 还原能力

还原能力见图7。

图7 还原能力Fig.7 Reducing power

抗氧化剂的还原力与抗氧化性之间存在着一定的联系。天然抗氧化剂通过将电子或氢原子释放出来与自由基结合，来破坏自由基链式反应，在反应中，还原剂的存在将Fe3+/铁氰化物复合物转化为亚铁形式时，黄色测试溶液变为绿色或蓝色。因此，在700 nm处的吸光度值越大表明还原能力越强。

还原力通常是通过评价天然抗氧化剂给出电子或氢原子的能力进行测定。天然抗氧化剂是通过给自由基提供电子或氢原子来打破自由基的链式反应，因此，物质的抗氧化活性在还原力上也有所体现。试验结果表明（图7），在3种沙棘油中，沙棘籽油有较强的供电子能力，沙棘全果油次之，相同浓度范围内，VC的还原能力保持不变，且明显高于3种沙棘油。

2.4.3 总抗氧化能力

采用钼酸铵法对咖啡酸的总抗氧化能力进行测定，抗氧化物质可以将Mo（Ⅵ）还原为Mo（Ⅴ），并且在酸性条件下形成绿色Mo（Ⅴ）的磷酸盐在734 nm处有较强的吸收，吸光度值越大表明抗氧化性越强。

根据1.3.4.3的方法，将样品配置成一系列浓度梯度进行试验，分别测定其在734 nm处的吸光度，吸光度值越大表明该物质的抗氧化性越好，在图8中所取浓度范围内，3种沙棘油的总抗氧化能力均表现出很好的量效关系，随着浓度的升高而升高，三者没有显著性差异，并显著低于相同浓度范围内VC的总抗氧化能力。

图8 总抗氧化能力Fig.8 Total antioxidant capacity

2.4.4 ABTS+自由基清除能力

在测定体外抗氧化能力时，有两种不同的方法，一种是基于电子的转移并还原有色物质，如ABTS法、DPPH法和FRAP法。另一种则是基于氢原子的转移，如ORAC法，抗氧化剂和底物竞争热反应产生的过氧自由基。在ABTS+自由基反应中，抗氧化剂通过抑制蓝绿色的ABTS+自由基的产生来评价抗氧化性。ABTS+自由基清除能力见图9。

图9 ABTS+自由基清除能力Fig.9 ABTS+free radical scavenging activity

从图9可以看出，除沙棘籽油外，沙棘果油和沙棘全果油的ABTS+自由基清除能力均有良好的线性关系，在0～5 mg/mL浓度范围内，沙棘籽油的清除率略大于其他两者，随后沙棘果油的清除能力逐渐超过沙棘籽油和沙棘全果油的清除能力。ABTS+自由基清除试验中沙棘籽油的EC50值为18.55 mg/mL，沙棘果油为10.90 mg/mL，沙棘全果油为15.14 mg/mL。试验结果表明，在清除ABTS+自由基能力上，沙棘果油＞沙棘全果油＞沙棘籽油。相同浓度范围内，VC对ABTS+自由基的清除能力基本保持不变，维持在100%左右。

3 结论

3种沙棘油主要含有棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸这5种脂肪酸，含量各不相同，3种沙棘油脂肪酸含量的区别主要在于亚油酸和亚麻酸，沙棘籽油含量约为64.52%、沙棘果油含量约为58.02%、沙棘全果油含量约为60.46%，其中以沙棘果油的亚油酸含量最高，以沙棘籽油的亚麻酸含量最高。3种沙棘油均有良好的体外抗氧化活性，具有作为天然抗氧化剂的潜力。

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