张文婷，李婕，陈健

（海南大学食品学院，海南海口570228）

近年来，罗非鱼因其肉质鲜美细嫩，逐渐替代传统白肉鱼，日渐受到欧美市场的青睐，尤其是罗非鱼冷冻鱼糜[1-2]。但是鱼糜中的蛋白质在冷冻和冷藏的过程中，容易发生冷冻变性，严重影响产品品质[3-4]。向鱼糜蛋白制品加入抗冻剂可以有效防止鱼糜蛋白的变性，目前常用卵磷脂、蔗糖和磷酸盐等作为抗冻保护剂。卵磷脂和蔗糖因甜度和热量高，影响了鱼糜及其制品的口味和健康营养价值[5-6]。磷酸盐尤其是三聚磷酸盐对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，添加在食品中能有效防止蛋白质变性、淀粉老化，抑制臭味、腐腥味的产生[7-9]。

三聚磷酸盐为白色结晶粉末，在水中极易溶解，黏着性很强，1%水溶液的pH值为9.5[10]。添加少量三聚磷酸盐，就能对肉制品起到很好护色、预防变质和分散的功效，还能增强脂肪的乳化性。添加三聚磷酸钠的肉制品，水分在高温加热后流失少，成品完整度较好、色泽无差异、肉质柔嫩，容易切片，切面有光泽，是应用最多的一种磷酸盐，最大使用量为1%。三聚磷酸盐还具有安全、无毒、易降解的性质，因此三聚磷酸盐可以作为优良的抗冷冻变性剂在食品工业中大量应用[11-12]。为了抑制冰晶的增长速率和形态学不稳定性，Enjakul等[13]通过原位观察的实验方法证明了三聚磷酸盐比蔗糖的效果更好。Kingduean等研究证实鲻鱼中Ca2+-ATP酶的活性只需0.5%的三聚磷酸盐即可完全抑制，并且最大限度的保持水分不冻结[14]。郭颖等在鱿鱼鱼糜中加入3种磷酸盐，发现焦磷酸钠、六偏磷酸钠和三聚磷酸钠添加量各为0.30%时，鱼糜的硬度、弹性达到最大[15]，由此证明了磷酸盐的优良特性。

三聚磷酸盐具有保护蛋白质分子的天然结构，保持食品风味和质地的效果[10]。同时，三聚磷酸盐作为抗冻剂，可以避免添加甜度较高的抗冻剂例如蔗糖、山梨醇等使鱼糜的甜度增加，从而影响产品风味[16]。本试验着重探讨三聚磷酸盐对冷冻罗非鱼鱼糜中蛋白质的保护作用，为将三聚磷酸盐作为冷冻鱼糜的抗冻保护剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗非鱼（每条鱼约500 g）：海口市沿江三东路农贸市场。

三聚磷酸盐（纯度≥99%）、磷酸盐缓冲溶液：北京索莱宝科技有限公司；Weber-Edsall溶液、双缩脲试剂：广州化学试剂厂；Tris-maleate溶液：南京森贝伽生物科技有限公司；ATP酶检测试剂盒：南宁中诺生物工程有限责任公司。

1.2 仪器与设备

组织捣碎机（DS-1）：郑州长城科工贸有限公司；多管架自动平衡离心机（TDZ5-WS）：上海安亭科学仪器厂；紫外分光光度计（UV1700型）：日本岛津公司；冰箱（BD-80）：青岛海尔电冰箱股份有限公司；电子天平（SHIMADZU AUW220）：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鱼糜制作流程

活罗非鱼→前处理（去鳞）→流水洗净→采肉→漂洗→脱水→打浆→添加三聚磷酸盐（添加量依次为0%、0.1%、0.3%、0.6%）→混匀→密封→-18℃冻藏

1.3.2 盐溶性蛋白含量的测定

准确称取一定质量并充分研碎成为鱼糜制品的罗非鱼，加入10倍体积（离子强度=0.05，pH=7.5）的磷酸盐缓冲溶液，提取5 min，在4 000 r/min下离心5 min，去上清液，重复上述步骤两次，取离心后的沉淀鱼糜加入10倍量的Weber-Edsall溶液（0.6 mol/L KCl-0.01 mol/L Na2CO3-0.04 mol/L NaHCO3），在 4℃下浸提20 h，4 000 r/min下离心7 min，测量上清液的体积，蛋白质含量用双缩脲法测定[17]。

1.3.3 制备肌原纤维蛋白溶液

准确称取一定质量的罗非鱼鱼糜制品，加入10倍体积pH=7.0，内含0.05 mol/L KCl的20 mmol/LTrismaleate缓冲液，充分匀浆1 min，在6 000 r/min的条件下低温离心10 min，洗去鱼糜样品中残留水溶性蛋白质。弃上清液，向沉淀鱼糜中加入10倍体积的pH=7.0，内含 0.6 mol/L KCl的 20 mmol/L Tris-maleate缓冲液，充分匀浆1 min后在4℃下浸提1 h，然后在6 000 r/min，4℃下离心10 min，上清液即为试验用肌原纤维蛋白溶液[18]。

1.3.4 肌原纤维蛋白Ca2+-ATP酶活性测定

肌原纤维蛋白Ca2+-ATP酶活力利用ATP酶检测试剂盒，在低离子强度下加入0.06 mol/L KCl、pH=7.0的25 mmol/LTris-maleate溶液测定。向0.2 mg/mL～0.4 mg/mL肌原纤维蛋白中加入1 mmol/L ATP和5 mmol/L CaCl2，混合物在25℃下反应5 min，最后将0.5 mL高氯酸溶液（质量分数15%）加入2 mL反应液中来结束反应。反应中释放的无机磷含量通常是采用钼酸铵法来进行测定，Ca2+-ATP酶活力用25℃恒温条件下，每分钟1 mg蛋白质所生成的无机磷的微摩尔数表示[19]。

式中：A为1 mL反应液生成的磷酸量，μmol；B为空白值，μmol；t为反应时间，min；酶蛋白质量为 1 mL反应液所含的酶量，mg。

1.3.5 自由液滴和加热液滴损失

参考文献[20]的方法，并稍微改动。

1.3.5.1 自由液滴测定

准确称取一定质量的罗非鱼鱼糜，立刻放入含有滤纸的培养皿中，密封在8℃～10℃恒温箱培养2 h后取出，用滤纸拭去鱼片表面的液体，立即称重，根据公式2计算自由液滴损失。

1.3.5.2 加热液滴测定

准确称取一定质量的罗非鱼鱼糜，放入具有盖子的铝质小盒内，用沸水蒸盖紧的铝制小盒10 min，取出后将试样放入带铜网的离心管，2 500 r/min下离心10 min后称取鱼糜重量，根据公式3计算加热液滴损失。

2 结果与分析

2.1 鱼糜冻藏过程中盐溶性蛋白含量的变化

罗非鱼鱼糜分别用4组不同浓度的三聚磷酸盐处理，并在-18℃条件下冷藏8周，每周观察一次盐溶性蛋白的含量变化，结果如图1所示。

图1 罗非鱼鱼糜盐溶性蛋白在冻藏过程中含量变化Fig.1 The change of salt-soluble protein content in tilapia surimi during frozen storage

经过三聚磷酸盐处理过鱼糜的盐溶蛋白含量下降率明显低于对照组（0%三聚磷酸盐）（P＜0.05）。在对照组中，从开始的第1周到第4周期间，盐溶蛋白含量由84.12%下降到54.27%，下降率达到35.49%，而对于分别添加质量分数为0.1%、0.3%和0.6%三聚磷酸盐处理后的试验组，下降率分别是32.20%、14.12%和12.13%。由此可说明，盐溶蛋白的含量在前4周都呈快速下降趋势，但添加三聚磷酸盐的各组下降率比对照组低，并呈浓度依赖关系。在第4周到第8周期间，各组中的盐溶性蛋白含量均平缓下降。对照组的盐溶性蛋白含量在第8周已经下降到原来的52.32%，而质量分数分别为0.1%、0.3%和0.6%的三聚磷酸盐试验组下降率分别是46.58%、30.16%和27.98%。图1结果表明三聚磷酸盐具有降低鱼糜制品在冻藏过程中盐溶性蛋白的损失，对蛋白质有显著的冷冻保护作用。从图1中还可看出，0.1%三聚磷酸盐效果要显著低于0.3%和0.6%，同时0.3%和0.6%三聚磷酸盐对盐溶性蛋白的溶出量相差仅为2.18%，因此从降低生产成本方面考虑，冷冻前的罗非鱼鱼糜采用0.3%三聚磷酸盐处理。

冷冻鱼糜的主要成分是肌原纤维蛋白质，但在冻藏过程中，肌原纤维蛋白发生化学反应，生成氢键、二硫键、疏水键和盐键，它们相互反应而产生聚集变性，导致盐溶性下降，从而使鱼糜制品的蛋白变性，产品出现问题[21-22]。三聚磷酸盐之所以能提高蛋白质的抗冻性，可能是由于蛋白质分子中的某些基团可以与三聚磷酸盐中的羟基发生反应，减少了蛋白质分子之间因官能团发生反应而产生的聚集变性[6]。另外三聚磷酸盐具有高的玻璃态转变温度，可减少冰晶体形成量，减缓蛋白质分子的相互聚集，间接地对蛋白质起保护作用[8]。

2.2 冻藏过程中鱼糜肌原纤维蛋白Ca2+-ATP酶活性变化

衡量鱼糜在冷冻贮藏过程中蛋白质性质的一个重要指标是Ca2+-ATP酶活性，活性值越高，表明鱼糜蛋白质性质越稳定，冷冻变性程度越小，品质也越好[23-24]。冻藏过程中鱼糜肌原纤维蛋白Ca2+-ATP酶活性变化见图2。

图2 罗非鱼鱼糜肌原纤维蛋白Ca2+-ATP酶活性在冻藏过程中含量变化Fig.2 The change of Ca2+-ATP activity in myofibrillar protein of tilapia surimi during frozen storage

由图2可知，罗非鱼鱼糜在-18℃冻藏30 d后，所有组鱼糜中的肌原纤维蛋白Ca2+-ATP酶活力均呈下降趋势。对照组（0%三聚磷酸盐）中该酶活力在冻藏前为0.82 μmol/（mg·min），而冻藏后只有0.23 μmol/（mg·min），下降率高达71.95%；而0.1%、0.3%和0.6%的三聚磷酸盐组，其肌原纤维蛋白中Ca2+-ATP酶活性分别由最开始的0.84、0.89、0.91 μmol/（mg·min）下降到0.29、0.42、0.47 μmol/（mg·min），下降率分别为65.48%、52.80%和48.35%。试验结果表明，三聚磷酸盐的加入能减少肌原纤维中Ca2+-ATP酶活性的下降。同时发现，分别经0.3%和0.6%三聚磷酸盐溶液浸渍处理的试验组对Ca2+-ATP酶活性影响差别不大。因此，考虑成本因素，选择0.3%三聚磷酸盐浸泡罗非鱼鱼糜后再冷冻，可使鱼糜蛋白质冷冻变性程度小。

2.3 冻藏过程中鱼糜液滴损失

冻藏过程中鱼糜液滴损失见图3、图4。由图3所示，不同浓度三聚磷酸盐溶液处理后的冻藏罗非鱼鱼糜，随着冻藏时间的增加自由液滴的损失，均明显低于对照组，持水能力得到大的改善。冻藏30 d后，对照组（0%三聚磷酸盐）自由液滴损失为3.19%，而0.1%、0.3%和0.6%三聚磷酸盐组的液滴损失分别为3.04%、1.21%和1.15%。继续冻藏到60 d后，添加三聚磷酸盐的3个组中自由液滴损失分别为对照组的81.41%、36.91%和35.60%。

由图4结果可知，罗非鱼鱼糜先经过三聚磷酸盐溶液处理再冷冻，在冻藏过程中加热液滴损失均小于对照组（0%三聚磷酸盐）。冻藏60 d后质量分数分别为0.1%、0.3%和0.6%的三聚磷酸盐组的加热液滴损失分别为38.57%、31.14%和32.02%，只有对照组的93.53%、75.51%和77.64%。由上述结果发现，在罗非鱼鱼糜冻藏过程中，加入三聚磷酸盐能有效的减少鱼糜的液滴损失。

图3 罗非鱼鱼糜在冻藏过程中的自由液滴损失Fig.3 The change of free droplets loss in tilapia surimi during frozen storage

图4 罗非鱼鱼糜在冻藏过程中的加热液滴损失Fig.4 The change of heating droplets loss in tilapia surimi during frozen storage

3 结论

罗非鱼鱼糜用0.3%三聚磷酸盐处理后，盐溶性蛋白损失明显减少，肌原纤维蛋白中Ca2+-ATP酶活性的下降率较低，并能减轻鱼糜的液滴损失，对罗非鱼鱼糜蛋白质的冷冻变性有明显的保护作用，可作为鱼类蛋白质冷冻保护物质。

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