李俊芳，景伟文，加列西·马那甫

（新疆农业大学化学工程学院，新疆乌鲁木齐 830052）

轮台小白杏是全球少有的特种优质杏果，俗称珍珠玫瑰杏，是杏中奇珍。新疆小白杏病虫、树体病害较为严重，南疆杏树主栽区树体虫害主要有蚧壳虫、春尺蠖、蚜虫和棕尾蛾等，科学预防杏树虫害、病害能力不足[1]。由于缺乏科学施药的指导，导致个别果农超标超量使用农药，为防止少量农药污染的小白杏流入市场，需建立准确高效的分析鉴定方法进行监测。小白杏是新疆特产之一，由于气候环境的影响在种植过程中所使用的农药类型与其他地区及国家的是不同的，因此本文拟建立更具有针对性和区域适用性的方法，此方法不仅可以应用于对外贸易检测，也可以为新疆地方标准的建立提供实验依据。

近年来，新技术、新方法的出现，对食品安全的分析起到了重要的促进作用。农药残留的检测虽有国家标准方法，国标方法中的检测仪器较为普遍，而大多数实验室所有的仪器并非与之一致，因此必须重新摸方法、优化条件；大多数的国家标准或行业标准仅针对同一类型或两个类型的多个农药进行检测，而对于不同类型多种农药的检测鲜见发布。本文拟建立适用于多种类型的多个农药的检测方法。

在众多方法中，液相色谱的应用范围较气相色谱的应用范围宽。超高效液相色谱（ultra high performance liquid chromatography，UHPLC）[2-3]与传统的高效液相色谱（high efficiency liquid chromatography，HPLC）相比，分析速度和分离效果都略胜一筹。HPLC与多级质谱（multi-stage mass spectrometry，MSn）的联用技术已广泛应用于食品安全领域[4-7]。采用UHPLC-MS/MS技术进行农药多残留成分的快速分析时，子离子或碎片离子提供的结构信息是定性和定量的重要依据。

Q Exactive将四级杆和Orbitrap高分辨技术结合起来，具有选择性好、灵敏度高、检出限低及样品无需衍生化等特点，在现有的农药残留检测技术中优势显著[8-16]。但在采用液相色谱串联质谱检测不同类型的农药时，某几种农药的碎片离子无法获得或碎片离子产率较低[17-21]，从而影响该方法的选择性和灵敏度。因此获取多种类型农药的碎片离子是进行液相色谱串联质谱分析的前提。通过优化相对碰撞能量（Normalized collisionenergy，NCE）可以有效提高碎片离子的产率[22]。不同物质的碰撞能量往往不同，通常由NCE（%）表示。NCE（0%～100%）与共振激发电压（0～2.5 V）有关，母离子的质荷比大小决定着NCE的大小。增大NCE可增强共振激发电压，提高母离子的平动动能，增加母离子与阱中阻尼气体（氮气）的碰撞次数，从而提高母离子内能及产生碎片离子的产率[23]。

本文优化了时下最流行的快速样品前处理技术（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe，QuECh－ERs）提取方法[24-25]、分散固相萃取法（disperse-solid phase extraction，d-SPE）净化条件，并采用优化后的NCE能量对新疆小白杏中7种常见农药多残留量进行检测，获得了较好的分析结果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小白杏为新疆轮台地产：北园春农贸批发市场。

吡虫啉（纯度＞97.5%）：Dr Ehrenstorfer GmbH公司；毒死蜱、氰戊菊酯、辛硫磷、嘧啶磷、氯氰菊酯、杀扑磷标准品（纯度＞99%）：农业部环境保护科研监测所；甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）：色谱纯，Fisher公司；甲酸（FA）、醋酸（HAc）：分析纯，上海国药集团；无水硫酸镁、无水醋酸钠、氯化钠：均为分析纯，上海国药集团，用前在马弗炉500℃灼烧4 h，冷却后贮于干燥器中备用；N-丙基乙二胺（PSA）、C18封端的硅胶（C18E）：Agela博纳艾杰尔科技；0.2 μm 有机相微孔滤膜：美国Thermo-Fisher公司；实验用水：艾柯纯水仪制备高纯水。

1.2 仪器与设备

Q Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统：配有热喷雾离子源HESI及Xcalibur 2.0数据处理系统、Dionex UltiMate 3000快速高效液相色谱系统：美国Thermo-Fisher公司；TD5A-WS离心机：上海湘仪离心机厂；HZQ-50H回旋振荡器：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 样品前处理方法

称取10.0 g试样于50 mL具塞离心管中，加入10.0mL含1%乙酸的乙腈液，上下振荡30min，加入1g醋酸钠、4.00 g无水硫酸镁，加入相应量的农药标准品（空白不加标准品），手动上下振荡1 min，4 200 r/min离心5 min，取1 mL上清液快速加入装有0.15 g无水硫酸镁和0.05 g PSA及0.05 g C18E的10 mL离心管中，快速手动振摇20次，4 200 r/min离心5 min，取上清液过0.2 μm有机微孔滤膜，装入进样小瓶中待LCMS/MS测试。

1.4 测试方法

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Thermo aQ C18柱（100 mm×2.1 mm，i.d.，2.6 μm）；流动相：5 mmol/L 醋酸铵水（A）和 0.1%乙酸乙腈（B），梯度洗脱见表1。流速0.2mL/min，柱温20℃；进样量 5 μL。

表1 流动相的梯度洗脱程序Table 1 Gradient program of mobile phase

1.4.2 质谱条件

Q Exactive质谱仪配备着HESI电喷雾离子源（正离子模式）；室内环境控制在温度20℃、相对湿度40%；喷雾电压：3.5 kV；HESI源温度：300℃；离子源温度：250 ℃；鞘气：35 arb；辅助气：10 arb；反吹气：0 arb；S-lens RF电压55 V；源内氮气99%；高能碰撞池HCD及C-Trap中的缓冲气均为高纯氮99.99%；每3天校正一次质量轴；所有定量数据均由全扫描/target-MS2模式得到，该模式是由全扫描模式联合vDIA碎裂方式，依据碎片离子能量进行dd-MS2的子离子扫描组成；全扫描质谱的分辨率在70，000FWHM；自动增益控制（automatic gain control，AGC）设为 1.0e6，最大离子进样时间（injection time，IT）为 100 ms；扫描范围m/z 50～500；默认相对碰撞能量（NCE）为35%。

2 结果与分析

2.1 正离子模式下裂解途径

对7种农药标准品同时进行正负离子扫描，结果发现正离子模式下的响应信号远高于负离子模式下的响应信号，因此，本文的所有测试均选用正离子模式。

对小白杏中常用的7种农药，在默认质谱条件下（NCE为60%）进行分别直接进样测试，得到7张质谱图，根据碎片峰，推测可能的碎片结构，并解出7种农药的质谱裂解规律图，如图1～图7所示。

由图1～图7可知，在较高的碰撞能量下，母离子得到了较多的子离子，有利于做定性分析。但是对于个别几种化合物，碰撞能量为60%时，出现了超过5个碎片离子，说明该化合物的量被分散到了5个以上的离子当中，在定量分析中是不利的。选择合适的能量，使化合物产生特征的2～3个碎片离子，可以得到更好的定性及定量结果。

图1 吡虫啉的质谱裂解图Fig.1 Hypothetical fragmentation pattern of Imidacloprid

图2 辛硫磷的质谱裂解图Fig.2 Hypothetical fragmentation pattern of Phoxime

图3 杀扑磷的质谱裂解图Fig.3 Hypothetical fragmentation pattern of Methidathion

图4 嘧啶磷的质谱裂解图Fig.4 Hypothetical fragmentation pattern of Pirimiphos

图5 毒死蜱的质谱裂解图

图7 氰戊菊酯的质谱裂解图Fig.7 Hypothetical fragmentation pattern of Fenvalerate

2.2 质谱相对碰撞能量的优化

离子阱质谱可以储存离子、进行多级扫描，具有快速和高灵敏度的优点，所以它可以提供分子组成和结构的丰富信息。离子阱质谱分析样品时，通过调节相对碰撞能量（NCE），就可以增加碎片离子的种类[20-21]。其原理为：NCE与共振激发的电压相关，增大NCE可增强共振激发电压，提高母离子的平动动能，增加母离子与阱中阻尼气体（高纯氮气）的碰撞次数，从而提高母离子内能及产生碎片离子的产率[22]。但，能量过高，产生过多不具特征性的子离子，不利于建立母离子-子离子的定量关系。所以选择合适能量可有效提高定量离子的响应值，增加定量的灵敏度。

本试验对7种农药中特征的几种碎片离子进行碰撞能量的优化，得到能量-响应图见图8所示，由该图可以很明显的观察到响应值最高的碎片离子，即可作为定量离子：其次可以发现不同碎片离子的最佳碰撞能量，作为质谱测试的最佳碰撞能量条件。

由图8可以看出m/z 256.10是吡虫啉3种碎片离子中响应值最高的一个，因此在定量分析中，选用此离子为定量离子。当碰撞能量NCE为35%时，m/z 256.10的响应值最高，所以确定测试吡虫啉的碰撞能量为35%。按照此方法得到辛硫磷、杀扑磷、嘧啶磷、毒死蜱、氯氰菊酯、氰戊菊酯农药的最佳碰撞能量分别为：45%、45%、35%、35%、60%、60%。

图8 吡虫啉碎片离子的碰撞能量优化图Fig.8 Fragment ions collision energy optimization diagram of Imidacloprid

2.3 质谱条件的选择

由于Q Exactive质谱仪结合了四极杆质谱与Obitrap质谱各自的优点，具有高分辨率和高灵敏度的特点。与三重四极杆质谱定量手段不同，Q Exactive质谱在Full Scan/dd-MS2模式下应用vDIA碎裂模式，同时进行全扫描和全范围+二级质谱扫描，具有更好的定性、定量准确度。在HESI+模式下，对7种农药的质谱条件进行了优化，分别采用Full Scan和Full Scan结合dd-MS2的子离子扫描方式，优化得到了母离子、子离子及最佳碎裂能量，以响应值最大的子离子为定量离子，以相对丰度较高的两个离子对为定性依据，增加了定性的准确度，从而得到了最优的质谱条件见表2。

表2 7种农药的的质谱采集参数Table 2 MS Parameters for 7 pesticides

2.4 超高效液相色谱串联轨道离子阱质谱条件的确定

采用优化后的色谱条件、质谱条件及优化后的碰撞能量，得出小白杏中7种常见农药的总离子流图及其各农药的提取离子色谱图，如图9所示。7种农药的提取离子色谱图峰型较尖锐，几乎无其他杂峰，说明此条件可用于实际样品中该7种农药的分析测试。

采用Q Exactive质谱仪在UPLC-HRMS/MS条件下，对基质共存的多种农药进行分析，结果发现在纯溶剂中样品的离子峰强度或大于或小于在基质中样品的离子峰强度，说明基质在一定程度上影响着农药的电离。

2.5 方法学验证

2.5.1 线性方程、相关系数

准确移取100 mg/L甲醇标准储备液10、30、50、70、100 μL于10.0 mL容量瓶中，并用甲醇定容，得到一系列不同浓度的标准溶液。按已优化好的条件进行测定，分别以化合物离子峰面积y对浓度x拟合线性方程，相关系数r均大于0.9，各组分的线性方程、线性范围、检出限、定量限列于表3。

图9 小白杏中7种农药的提取离子色谱图（基质加标量1 mg/kg）Fig.9 Extracted ion chromatogram of 7 pesticides（spiked in 1 mg/kg）

2.5.2 检出限和定量限

以空白小白杏加标实验（加标量0.1 mg/kg，取6各独立样品进行测试）在仪器上的响应为基础，以3倍信噪比所对应的浓度为方法的检出限，得出7种农药的检出限[LOD=3S/b（S峰面积的标准偏差，b为标准曲线的斜率）]；以10倍S/N所对应的浓度为方法的定量限[LOQ=10S×c/X（S峰面积的标准偏差，c加标浓度，为测定结果的平均值）]，相关结果见表3所示。

2.5.3 回收率和精密度

准确称取10.000 g小白杏匀浆后样品，按照1.3节方法进行处理，按照1.4节条件进行测试，测定7种农药的含量，平行测定5次，计算平均含量及RSD，结果列于表3。

采用实际样品添加标样的方法测定回收率。去10.000 g小白杏匀浆后样品，分别加入一定量的7种农药标样，按照1.3节和1.4节的方法进行处理和测试，并根据原含量、加标量测定量计算回收率和RSD，结果见表3。

表3 方法学验证结果Table 3 Summary of validation results

2.6 实际样品的定量效果验证

为了考察方法的定量准确性，准确称取10.0 g市售小白杏匀浆后样品，按照1.3节方法进行处理，按照1.4节条件进行测试，测定7种农药的含量，该方法对实际小白杏样品（购自乌鲁木齐市新北园春批发市场）进行了两个加标浓度水平的测定见表4。

表4 实际小白杏样品分析验证结果总结Table 4 Summary of confirmatory results obtained by analysis of real apricot samples

由表4的验证结果可知，通过对空白样品和加标样品的对比分析，可以得到良好的定量结果。

3 结论

本文建立了集QuEChERs提取方法、d-SPE净化技术和超高效液相色谱串联高分辨质谱的方法，通过优化相对碰撞能量，对新疆小白杏中的7种常见农药进行了测试，结果表明，经过NCE优化后的质谱响应值要高于未优化的结果。考察了方法的线性范围、线性方程、定量限、加标回收率及RSD，试验结果表明，该方法具有较高的准确度和灵敏度，满足新疆小白杏中农药多残留的检测目的与要求，并为建立新疆地方标准提供试验依据。

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