魏敏，宋旭艳，罗诚浩，潘曦，郭国宁

（湖北中烟工业有限责任公司技术中心，湖北武汉430040）

咖啡（coffea.spp.）是茜草科（Rubiaceae）、咖啡属（coffea）常绿灌木或小乔木，和茶叶、可可并称为世界三大饮料，是世界第二大贸易产品。目前对咖啡香气成分及各种影响因素的研究较多，周斌等[1-4]研究了不同溶剂、方法、烘焙时间、不同产地对烘焙咖啡的香气成分的影响，吴桂苹等[5]采用电子鼻对咖啡的品质进行了研究，佟世生等[6]对发酵处理和酶解偶联发酵处理的云南小粒咖啡鲜果和生豆进行电子舌检测及主成分分析和聚类分析，程金焕等[7]研究了酶促发酵在咖啡初加工过程中的影响；Alonso-Salces等[8]采用高效液相色谱-二极管阵列检测器-电喷雾碰撞诱导解离-串联质谱在线检测了咖啡豆中的化学成分，Baggenstoss等[9]研究了咖啡豆烘焙过程中时间-温度对芳香性成分形成的影响，Frauendorfer等[10]对烘焙前后咖啡豆中的芳香性成分进行了比较分析。本试验研究产香菌（桑肠杆菌L4-3）发酵对咖啡提取物挥发性成分的影响，鲜见报道，旨在为开发生物产香咖啡香料提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

桑肠杆菌Enterobacter mori VL4-3 CCTCC M2012020，从香荚兰植物的茎中筛选得到，于2012年1月16日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心；斜面培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基，BR）、原始种子培养基（麦芽糖蛋白胨培养基：麦芽糖50 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，BR）：北京三药科技开发公司；发酵培养基：市售咖啡豆粉粹到60目后，回流提取3 h的滤液；葡萄糖、琼脂、麦芽糖、蛋白胨、氯化钠、二氯甲烷、无水硫酸钠、95%乙醇：国药集团化学试剂有限公司，AR；马铃薯：市售；发酵底物为咖啡提取物：市售咖啡豆（产地巴西）。

SHP-080生化培养箱：上海精宏试验设备有限公司；YX.350Z灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司；SW-CJ-1FD超净工作台：苏净集团安泰公司；HQL 300B恒温摇床：武汉中科科仪技术发展有限责任公司；Agilent 6890N/5973型气相色谱质谱联用仪：安捷伦科技公司。

1.2 方法

1.2.1 微生物发酵咖啡提取物的制备

用接种环挑取一环L4-3到装有200 mL液体种子培养基的500 mL三角瓶中，32℃，100 r/min培养48 h。将咖啡豆粗粉和水按质量比1：20混合，回流提取4.5 h后，抽滤，取滤液，115℃灭菌20 min；将产香菌株L4-3接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在恒温培养箱中32℃、pH自然，静置培养60 h后置于4℃冰箱中；用上述斜面培养物，接种到种子培养基，在32℃，转速100 r/min条件下振荡培养28 h，连续转接3次后制得种子培养液；将种子培养液按体积比18%接种到咖啡滤液中，装罐量为30%，在pH自然、温度32℃、转速100 r/min，避光条件下，发酵48 h，得到咖啡发酵液，抽滤浓缩得到相对密度约为1.3的浸膏，与95%乙醇按质量比1∶3进行醇沉，静置过夜后抽滤，保留滤液，减压浓缩，制得黄褐色浸膏，密度为1.16，为微生物发酵咖啡提取物。

1.2.2 挥发性成分GC/MS对比分析

1.2.2.1 同时蒸馏萃取

将5 g微生物发酵咖啡提取物装入圆底烧瓶中，加入400 mL水，用电热套加热至沸腾，另一侧的圆底烧瓶中加入200 mL的二氯甲烷，60℃水浴沸腾，待中间分液管处液面出现分层后计时萃取4 h。萃取结束后，向二氯甲烷萃取液中加入无水硫酸钠，过夜，过滤并浓缩至1 mL，浓缩液用于进行GC/MS分析。同样的方法进行5 g未发酵咖啡提取物对照的同时蒸馏萃取，进行GC/MS分析。

1.2.2.2 挥发性成分GC/MS分析

HP-5MS（50 m×0.25 mm×0.25 μm）毛细管柱；进样温度：250 ℃；分流比 10 ∶1；载气：He，1 mL/min；升温程序：从 50℃（1 min）以 5℃/min升到 250℃（5 min）；传输线温度：250℃；离子源：EI源；电子能量：70 eV；扫描范围：50 amu～400 amu；使用WILEY和MINILAB谱库进行检索。

2 结果与分析

微生物（桑肠杆菌L4-3）发酵咖啡提取物及其对照的挥发性成分GC/MS分析结果见表1。

表1 微生物发酵咖啡提取物及其对照的挥发性成分GC/MS对比分析Table 1 Comparative analysis of volatile components in GC/MS between the microbial fermented coffee extract and its control

续表1 微生物发酵咖啡提取物及其对照的挥发性成分GC/MS对比分析Continue table 1 Comparative analysis of volatile components in GC/MS between the microbial fermented coffee extract and its control

由表1可知：咖啡提取物对照共分离鉴定出32种挥发性香气成分，主要包括酮类、高级脂肪酸酯类、呋喃和酚类；微生物发酵咖啡提取物共分离鉴定出34种香气成分，其中酸类3种（25.48%），烯类7种（11.15%），醇类6种（8.62%），酯类 4种（6.84%），醛类5种（2.21%），酮类5种（2.04%），酚1种（6.46%），烷烃1种，其他杂环化合物2种；微生物发酵咖啡提取物挥发性成分中，新出现了17种香气成分，主要有异戊醛、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸、青叶醛、苯甲醇、3-甲氧基苯乙酮、香兰素、棕榈酸乙酯及其他烯酮、烯醛、呋喃、醇、酯等。其中，异戊醛能提调嗅香，3-甲基丁酸是酸性物质成分，增添水果、酒和乳脂等风味，改善辛辣刺激，对喉部有柔和滋润作用；2-甲基丁酸相对含量较高（约17%），能赋予坚果和黄油的香气。有些小分子的有机酸、烯酮类、四氢呋喃类物质可能是酯类等大分子物质微生物转化、氧化分解等代谢产物；香兰素能增加食品的香荚兰香气，丰富香气提升品质，可能是咖啡液中的阿魏酸、愈创木酚、对乙烯基愈创木酚、4-乙基愈创木酚等经微生物酶体系催化转化而来；4-甲氧基苯乙酮，有山楂花和类似茴香醛香；双丙酮醇，有愉快香气；棕榈酸乙酯是高级脂肪酸酯，具有淡甜柔和香气；微生物发酵咖啡提取物中，己酸、2-糠醇、苯乙醇、亚油酸乙酯等成分的含量有不同程度的提高。己酸是低碳链的有机酸；2-糠醇带焦香；苯乙醇具有清甜玫瑰香气；亚油酸乙酯具有典型的果香味；⑤经微生物发酵，咖啡提取物中的一些大分子成分消失或含量降低，如2-甲基戊酸甲酯、愈创木酚、4-乙基愈创木酚、对乙烯基愈创木酚、苯乙烯、2，4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸丁基-2-乙基己酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯等。邻苯二甲酸二丁酯及其他两种邻苯二甲酸酯类、2，4-二叔丁基苯酚、苯乙烯等属有害成分，吸入可引起喉部刺激，经微生物酶体系作用而分解、降解，有利于咖啡提取物香气质的提高。所有这些香气糅合在一起，赋予发酵咖啡提取物具有咖啡特征香气的同时，带有浓郁坚果奶香等丰富、醇厚香气，其香气质提高，刺激性、苦涩感、有害物质减少。

3 结论

咖啡提取液经微生物（桑肠杆菌Enterobacter mori L4-3）发酵后，对其挥发性香气成分影响较大，新增、相对含量变化以及消失的成分较多，赋予发酵咖啡提取物在富有咖啡特征香气的同时也具有浓郁坚果奶香等丰富、醇厚香气，刺激性成分减少、苦涩感减少，香气自然丰富，香气质提高。本研究旨在研究采用微生物转化技术提升天然香料品质，为提高天然香料的可用性和经济价值提供新的参考途径，并且提供其在食品中的应用转化理论基础，未来将进一步深入研究生物技术对天然香原料的提质加工的作用。

参考文献：

[1]周斌,任洪涛,夏凯国,等.云南小粒咖啡的香气成分分析[J].现代食品科技,2013,29(1):186-188

[2]周斌,任洪涛,秦太峰.两种前处理方法在云南小粒咖啡香气成分分析中的对比[J].现代食品科技,2013,29(7):1716-1720

[3]张丰,董文江,王凯丽,等.云南不同地区烘焙咖啡豆挥发性成分的HS SPME/GC MS分析[J].食品工业科技,2015,36(11):273-280

[4]周斌,任洪涛.烘焙时间对云南小粒咖啡挥发性成分影响的研究[J].现代食品科技,2015,31(1):236-244

[5]吴桂苹,胡荣锁,卢少芳,等.电子鼻在咖啡产品品质检测中的应用研究[J].香料香精化妆品,2011,10(5):7-9

[6]佟世生,王丽,靳静言,等.酶解偶联发酵体外模拟麝香猫咖啡的电子舌相关性分析[J].食品工业科技,2015,36(22):133-142

[7]程金焕,何红艳,李慧敏,等.酶促发酵在咖啡初加工过程中的应用初探[C].昆明:第十六届中国科协年会——分17精品咖啡豆认证与公平交易及庄园标准化国际论坛论文集,2014

[8]Alonso-Salces RM,Guillou C,Berrueta LA.Liquid chromatography coupled with ultraviolet absorbance detection,electrospray ionization,collision-induced dissociation and tandem mass spectrometry on a triple quadrupole for the on-line characterization of polyphenols and methylxanthines in green coffee beans[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2009,23:363-383

[9]Baggenstoss J,Poisson L,Kaegi R,et al.Coffee roasting and aroma formation:application of different time-temperature conditions[J].Agric.Food Chem.,2008,56:5836-5846

[10]Frauendorfer F,Schieberle P.Changes in key aroma compounds of criollo cocoa beans during roasting[J].Agric Food Chem,2008,56:10244-10251