蓝尉冰，韩鑫，陈冠余，陈美花1，，4

（1.广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室/北部湾海洋生物资源开发与保护重点实验室，广西钦州535099；2.钦州学院，广西钦州535099；3.广西大学，广西南宁530004；4.广西北部湾特色海产品资源开发与高值化利用高校重点实验室，广西钦州535099；5.武汉理工大学，湖北武汉430063）

近江牡蛎，属软体幼物门[1]，是广西沿海地区特有的名贵海洋贝类品种，主要分布在北海市西部到防城港一带河口附近低盐海区，钦州龙门附近茅尾海出产的牡蛎历史最为悠久[2]。其以肉质鲜美，营养丰富，蛋白质含量超过40%，被称为“海中牛奶”，此外，近江牡蛎含有丰富的生物活性肽物质，当前有现代医

学研究表明活性肽具有很高的医学药用价值，在降低血糖、血压、抗肿瘤、抗氧化和提高免疫力等领域都具有特殊的生物活性[3-10]。广西北部湾沿海天然近江牡蛎资源丰富，主要分布于茅尾海海域附近[11]，因此，充分利用地理优势，研究近江牡蛎活性肽提取工艺，对其药用开发与利用具有重要意义。超声提取作为一种新型的辅助提取手段，已广泛应用于化学、食品等许多科学研究领域。超声空化效应促进细胞壁的破坏，增强溶剂和目标化合物之间的接触[12]，超声波细胞破碎的原理主要是由电能转化得到的声能通过液体介质而变成一系列小气泡，气泡炸裂随之引起破碎细胞的作用[13]。且破坏完整的空间结构，部分弱键断裂，内部非极性基团暴露到分子表面，增大酶接触位点，使提取过程更高效，更环保[14]。酶解法破坏细胞壁的特殊化学键，达到破壁效果，其具有高度专一性，条件温和，一般不会破坏原料物化性质。欧成坤等[15]认为随着水解程度的增大，大分子的蛋白质不断被水解成小分子肽类，与此同时水解产物对蛋白酶活性的抑制作用也减弱，由此可知，可通过测定酶解液氨基态氮（amino acid nitrogen，AAN）含量间接表征活性肽含量[16]。本试验期望通过超声波预处理辅助酶酶解，考察料水比、超声功率、加酶量、pH值、酶解时间对近江牡蛎活性肽提取率的影响，以氨基态氮（amino acid nitrogen，AAN）含量为指标反映活性肽含量，即氨基态氮含量越大，近江牡蛎的水解程度越大，酶解液中活性肽的含量越大。利用正交试验法对相关参数进行优化，确定最佳提取工艺，以提高近江牡蛎活性肽提取率，为不同海域牡蛎活性肽含量对比及其结构分析提供理论数据指导，并为近江牡蛎高值产品加工多样化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

近江牡蛎：钦州市鸿发市场；碱性蛋白酶（5.0×104U/g）、胰蛋白酶（5.0×104U/g）、酸性蛋白酶（5.0×104U/g）、中性蛋白酶（5.0×104U/g）：无锡酶制剂厂；菠萝蛋白酶：广西南宁庞博生物工程有限公司；DKrS28型电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；H1850R型台式高速冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Phs-2型酸度计：上海第二分析仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 酶种的选择

将新鲜的近江牡蛎肉清洗后用组织捣碎机捣碎，取10 g肉浆，按表1进行试验，后加热100℃灭酶活15 min，后将酶解液以4 000 r/min离心15 min，取其上清液到50 mL的容量瓶定容，待用[17-19]。

表1 酶种及其条件Table 1 Enzyme species and conditions

1.2.2 单因素试验

以氨基态氮为指标，考察料水比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 g/mL），超声功率（100、200、300、400、450、500 W）；加酶量（400、800、1 200、1 400、1 600 U/g），pH 值（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5），水解温度（40、45、50、55、60 ℃），水解时间（2、3、4、5、6 h）7 个因素对其影响，确定最佳工艺的因素水平。

1.2.3 正交试验优化

以单因素试验为依据，根据正交试验设计原理[20]，选取对近江牡蛎活性肽提取有较大影响的超声波功率、pH值、料水比、加酶量、酶解时间5个因素，设计五因素四水平正交试验，以优化提取工艺。因素与水平见表2。

表2 因素水平表Table 2 actor level table

1.2.4 氨基态氮（AAN）含量测定

氨基态氮（AAN）含量测定采用电位滴定法[18]。

2 结果与分析

2.1 酶的确定

为选出合适酶种，分别选取碱性蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶+菠萝蛋白酶，并在其最佳作用条件下进行酶解，所得结果如图1所示。

图1 5种外源性蛋白酶对近江牡蛎酶解效果图Fig.1 Effect of five exogenous proteases on enzymatic hydrolysis of Ostrea rivularis Gould

5种蛋白酶对近江牡蛎的酶解效果不一致。其中，碱性蛋白酶水解效果最大，为8.44 mg/g，中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶+菠萝蛋白酶相差不大，分别为5.50、5.71、6.20 mg/g，酸性蛋白酶酶解效果最差，为4.48 mg/g，约为碱性蛋白酶1/2。不同种类酶水解效果不一致可能是不同的酶对牡蛎蛋白肽链的作用位点不同，在不同的环境下酶对蛋白质的作用效果有所区别。此结果与付劲[21]效果趋势基本是一致的。由此可选碱性蛋白酶进行酶解试验。

2.2 料水比对近江牡蛎活性肽提取影响

料水比对近江牡蛎活性肽提取影响结果见图2。

图2 料水比对近江牡蛎活性肽提取影响Fig.2 Effect of solid-water ratio on extraction of bioactive peptides from Ostrea rivularis Gould

由图2可知，料水比是影响酶对近江牡蛎活性肽的酶解效果的因素之一。随着水分浓度的增大。溶液中活性肽含量逐渐增多，但加入过多的蒸馏水，碱性蛋白酶被稀释，酶解效果降低，浆液本身总活性肽含量下降，造成资料浪费，超声破碎利用不充分。加入的蒸馏水太少，近江牡蛎液浓度过高时超声波空化作用难形成[22]，不利于蛋白质释放，影响到酶与底物的接触面积，从而使酶解的效果降低。故宜选取料水比为1∶4（g/mL）。

2.3 超声功率对近江牡蛎活性肽提取的影响

超声波功率对近江牡蛎活性肽提取影响结果见图3。

图3 超声波功率对近江牡蛎活性肽提取影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction of bioactive peptides from Ostrea rivularis Gould

从图3可知，超声波功率对提取活性肽有显著影响。在100 W～450 W，氨基态氮含量随超声波功率增大而增大，在450 W达到最大值为15.51 mg/g，后降低。其原因可能是空化效果随超声波功率变大增强，超声波对细胞壁的破碎作用也随之增强[23]，活性肽释放率逐渐增大，表征出来的氨基态氮含量也逐渐增大。但随着功率达到450 W后，活性肽溶出速率未见显著提升。与江凌等[24]的研究结果基本一致，试验宜选450 W超声波功率。

2.4 加酶量对近江牡蛎活性肽提取影响

加酶量对近江牡蛎活性肽提取影响结果见图4。

图4 加酶量对近江牡蛎活性肽提取影响Fig.4 Effect of enzyme dosage on extraction of bioactive peptides from Ostrea rivularis Gould

从图4可知，当加入酶的量越多，氨基态氮的含量就越多，当加酶量达到1 400 U/g时，含量最高，加入的量大于1 400 U/g，含量相对降低，说明在加酶量为1 400 U/g时，酶与底物的结合达到了饱和的状态。故水解近江牡蛎的宜选加酶量为1 400 U/g。

2.5 pH值对近江牡蛎活性肽提取影响

pH值对近江牡蛎活性肽提取影响结果见图5。

图5 pH值对近江牡蛎活性肽提取影响Fig.5 Effect of pH on extraction of bioactive peptides from Ostrea rivularis Gould

由图5可知，随着pH值的增加，氨基态氮的含量呈现先上升后下降的趋势。这是因为pH值是使酶变性的一个重要原因，而蛋白酶在强酸强碱的环境下，酶因相互减弱，对相同电符的基团互相排斥而表现不稳定，酶分子上的催化基团、结合基团和其它基团的电离作用发生了改变，最终使酶变性失活。碱性蛋白酶对近江牡蛎水解的适宜pH值为8.5。

2.6 酶解时间对近江牡蛎活性肽提取影响

酶解时间对近江牡蛎活性肽提取影响结果见图6。

图6 酶解时间对近江牡蛎活性肽提取影响Fig.6 Effect of enzymolysis time on extraction of bioactive peptides from Ostrea rivularis Gould

从图6可知，随着酶解时间的延长，氨基态氮的含量明显增大，当酶解时间在3 h以上时，氨基态氮含量基本保持不变，主要因为在加酶量不变的情况下，随着酶解时间的延长，酶和底物的反应越充足，最后使蛋白酶达到饱和的状态而不能使反应持续地进行，从而使得酶解产物随着酶解时间的延长而保持产量不变的现象。但由于在试验中在合理的情况下选取的时间越短越好，避免蛋白质变性而给实验带来的误差，因此为了合理安排试验所需要的时间，酶解3 h时是水解的适宜时间。

2.7 正交试验结果

在王一兵[14]对近江牡蛎的酶解工艺研究中，超声波时间对酶解的效果影响不大，而据文献资料中对碱性蛋白酶对牡蛎的最佳酶解工艺研究结果显示[17]，温度属于次要因素，因此在正交试验中可以不考虑这两个因素。故选取超声波时间为10 min，温度为55℃，考察超声功率、pH值、料水比、加酶量、酶解时间五因素四水平的正交试验，结果如表3所示。

表3 正交试验结果Table 3 Results on orthogonal test

从表 3 中的试验结果 RD＞RC＞RE＞RB＞RA可知，各因素的对活性肽提取影响的主次顺序为：D（加酶量）＞C（料水比）＞E（酶解时间）＞B（pH 值）＞A（超声波功率）；在此试验中试验指标越大越好，所以碱性蛋白酶辅助超声波后的最优水解条件为：A3B1C2D3E2即超声波功率为 450 W，pH 值 8.0，料水比为 1∶3（g/mL），加酶量为1 400 U/g，酶解时间3 h。

一般的，在正交试验设计结果的方差分析中，正交表中没有安排空列项，即没有误差项，则可把对水解效果影响最小的因素项当作误差项进行方差分析。因此在本试验中因素A可当作误差项对试验结果进行进一步的验证分析。方差分析表如表4所示。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

据表4中的F值可知，因素的主次顺序为D（加酶量）＞C（料水比）＞E（酶解时间）＞B（pH 值）＞A（超声波功率），这与极差分析的结果是一致的，因此可以确定碱性蛋白酶辅助超声波后对牡蛎的酶解的最优方案为A3B1C2D3E2即超声波功率为450 W，pH值为8.0，料水比为 1∶3（g/mL），加酶量为 1 400 U/g，酶解时间 3 h。

综上所述，碱性蛋白酶辅助超声波后对近江牡蛎活性肽提取的最佳酶解工艺为：超声波功率450 W，超声波时间 10 min，温度 55 ℃，pH8.0，料水比 1∶3（g/mL），加酶量1 400 U/g，酶解时间3 h。并在此条件下进行验证试验，在此试验中所测得的氨基态氮（ANN）含量为26.13 mg/g。比以上的试验中的氨基态氮的含量都要高，由此验证了此酶解工艺参数的准确性。确定了此酶解工艺条件对近江牡蛎活性肽提取实现工业化的可行性。

3 结论

采用超声波预处理协同酶技术从近江牡蛎提取活性肽，以氨基态氮含量为指标，在单因素实验基础上设计正交试验，考察了料水比、超声功率、加酶量、pH值、酶解时间对近江牡蛎活性肽提取的影响，得到最优提取工艺条件为：超声波功率450 W，超声波时间10 min，温度 55 ℃，pH8.0，料水比 1∶3（g/mL），加酶量1 400 U/g，酶解时间3 h。并在此条件下进行验证试验，在此试验中所测得的氨基态氮（ANN）含量为26.13 mg/g。

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