熊泰特 ，万小平 ，陈建林 ，肖永乐 ，陈义辉 ，熊 旗 ，李江，吕学斌 ★★，王泽洲 ，高 荣 ★

（1.四川大学生命科学学院,四川省生物资源与生态环境重点实验室，四川省动物疫病预防与食品安全重点实验室，四川 成都 610064；2.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066；3.四川省动物疫病控制中心，四川 成都 610035）

细胞因子是由机体多种细胞分泌的小分子蛋白质，通过结合细胞表面的相应受体发挥生物学作用。它可使细胞间的各种信使分子连成一动态网络，借以发挥其激活和调节免疫系统的多种功能，以便对外来的病原体感染或抗原性异物迅速作出免疫应答和其他生理反应（Smolen et al.,2005）。白细胞介素是一类研究最多、最深入的细胞因子，它们在免疫细胞的成熟、活化、增殖和调节等一系列过程中均发挥重要作用，此外它们还参与机体的多种生理及病理反应（Magyari et al.,2014）。IL-2（TCGF），主要由 T细胞产生，以自分泌和旁分泌方式发挥效应。其重要的作用是诱导T淋巴细胞增殖和分化（Lu et al.,1994），增强 CTL的细胞毒活性,增强细胞间的接触和诱导细胞分泌细胞因子（IFN-γ、IL-4、TNF和CSF 等）。

哺乳动物抗菌肽是生物体免疫防卫系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性阳离子多肽活性物质,是生物体先天免疫的重要组成成分（Kuzina L V et al.,2006）。抗菌肽作为固有免疫的重要分子，IL-2作为免疫调节的关键因子，二者各自的免疫生物效应不同；在体内是否具有免疫协同效应？联合应用能否获得能产生哪些调节效果,目前尚未见研究报道。

鉴于目前细菌耐药性日益严重，严重威胁人和动物的健康；动物因病原感染、应激等出现的免疫抑制十分普遍，给动物疫病的防治带来了严峻挑战，目前迫切需要研发新型安全高效的抗感染制剂，全面增强动物的抗感染先天免疫和获得性细胞和体液免疫水平，本实验开展了新型融合抗菌肽基因CAMPS与猪白细胞介素基因2重组质粒构建及其共表达的生物活性及对小鼠免疫调节的研究，为我国动物养殖业替代抗生素和增强免疫抗病力开拓新的途径、提供新技术支持。

1 材料和方法

1.1 材料

宿主菌∶E.coliDH5α本实验室保存。

载体∶pVAX1，购自Life technologies公司。

CAMPS：融合抗菌肽基因，由本实验室构建并保存。

藏猪IL-2重组质粒：本实验克隆保存。

人胚肾上皮细胞（HEK 293细胞）∶由四川大学国家生物材料工程研究中心王刚老师惠赠。

壳聚糖（ CS）∶MW15kD，脱乙酰度95%以上，购自Sigma-Aldrich公司。

21日龄昆明雌性小鼠：购自成都达硕生物科技有限公司。

1.2 共表达重组质粒的构建

利用IN-fusion克隆技术对实验室已构建好的CAMPS和IL-2分别进行修饰和重组，构建出CAMPS-IL2重组片段：IL2+2A+TPA+CAMPS。

将重组片段连入pVAX1表达载体，连接后转入大肠杆菌Mach1-T1 Phage Resistant感受态细胞，通过PCR筛选阳性克隆并测序，重组质粒记作VAP2。

1.3 CS-DNA纳米颗粒的制备

用离子交联法制备CS-DNA纳米颗粒。将CS溶解于pH5.5的醋酸溶液中，制备成浓度为2.4mg/mL的壳聚糖溶液，在55℃水浴磁力搅拌50rpm下过夜，彻底溶解后用滤膜（0.22μm孔径）无菌操作台过滤除菌。然后将其与质粒按照质量比30∶1的比例，在50～55℃水浴磁力搅拌情况下将质粒缓慢滴加至壳聚糖溶液中，混合均匀，恒温10min，最终得到包裹的纳米颗粒。用Zetasizer3000 HS/IHPL纳米粒度分析仪测定其粒径、分散度及Zeta电位。

1.4 体外转染HEK293细胞

将HEK293细胞置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，在37℃，5%CO2条件下进行培养，待细胞密度达到80%以上。用培养液调整细胞数至3×105个/mL，然后分配到6孔板中培养24h，至第2天细胞在孔板上达到90%左右的汇合度为准。分别于转录后的24h、48h以及72h收集细胞，提取总RNA，通过实时PCR检测重组真核表达质粒pVAX1、VAP、VAP2的转录表达水平。同时利用转染HEK293后48h的细胞上清液刺激猪外周血淋巴细胞，通过CCK8检测VAP2、VAP、pVAX1的表达水平以及表达产物的生物学活性。

1.5 小鼠实验

取30只体重位于20～25g左右的4周龄雌性昆明小鼠，随机分成3组（标记为A，B，C组），每组10只。于0d时A组小鼠注射含有100μg质粒的VAP2/CS纳米颗粒，B组小鼠注射同等剂量的VAP/CS纳米颗粒，C组小鼠注射PVAX1/CS作为阴性对照。于 0d，7d，14d，21d，28d 采集各组小鼠尾静脉血500μL左右，用于体内重组质粒的生物学分析。

1.5.1 免疫小鼠外周血免疫细胞数量的动态变化

每组各取50μL外周血用于血常规检测，分析小鼠外周血中白细胞、红细胞、血小板及血红蛋白等的变化情况。

1.5.2 CD4+和CD8+细胞亚群的检测

取新鲜抗凝小鼠尾静脉血50μL，加入30μL生理盐水（白细胞数量约为 105～107个）；然后吸取 1μLantimouseCD8-PE和 0.4μL antimouse CD4-FITC至 1.5mLEP管中，混匀，孵育20min；在流式细胞仪专用试管中加入0.2mL10倍裂解液，再加入1.8mL水，将孵育好的血液加入裂解液中，裂解5～10min；400～500g离心5min，弃上清。加入2mLPBS，吹打混匀，悬浮细胞；400～500g离心 5min，弃上清，留约100μL PBS轻轻吹打混匀，共洗涤1～2次；最后用100μL PBS吹打混匀细胞待检测。

1.5.3 血清中IgG、IgG1、IgG2a的测定

200 μL外周血低速离心后分离血清，用以检测体液免疫反应。参照ELISA试剂盒说明书进行。

1.5.4 荧光定量检测免疫相关基因表达水平

根据根据GenBank中报道的小鼠相关基因：β-actin,TLR1,TLR4,TLR9,IL-2,IL-4,IL-23,以及IFN-γ基因的cDNA序列，设计合成了8对扩增引物。以β-actin作为内参基因，利用实时荧光定量PCR（IQ5 Real Time PCR cycler,Bio-Rad）分析上述基因的表达情况。

表1 荧光定量PCR设计引物

1.5.5 小鼠体重监测

每周于固定时间测量每只小鼠体重，并做好记录，用于小鼠生长情况分析。

1.5.6 攻毒实验

免疫接种28d后，3组小鼠随机各选5只注射0.2mL OD=1的高耐药金黄色葡萄球菌液，剩余小鼠则注射同等剂量的大肠杆菌液，饲养1周后观察各组小鼠发病率和存活率。

2 结果

2.1 PCR扩增产物的鉴定

经质粒PCR以及HindⅢ、XbalⅠ酶切鉴定，测序验证，猪白细胞介素2与抗菌肽融合基因CAMPS成功构建。VAP和VAP2融合基因克隆成功。VAP2 cDNA全长1150bp，编码341个氨基酸。

2.2 包裹纳米颗粒的粒径、分散度和Zeta电位

通过0.7%琼脂糖凝胶电泳，发现样品凝胶孔中三种纳米颗粒被阻滞，孔外未检测到质粒分子。证明CS已成功包裹所有质粒分子形成纳米颗粒。Zeta-sizer 3000 HS/IHPL检测纳米颗粒的粒径、分散度以及Zeta电位。检测结果表明，所有的纳米颗粒大小在250～350nm之间，均带有正电荷，满足转染细胞要求。

表2 三种纳米颗粒的粒径和表面电位

2.3 CS/VAP、VAP2纳米颗粒的体外生物学活性

首先，我们将CS包裹的VAP、VAP2纳米颗粒转染HEK293细胞，经过24h、48h观察，细胞均生长良好，说明此包裹材料具有较低的细胞毒性，转染成功。随后通过RT-PCR验证纳米颗粒的转染和基因表达效率。结果表明，转染VAP和VAP2的HEK293细胞中提取的总RNA出现了目的条带，大小约125bp，然而对照组却没出现特征条带。通过PCR产物与定量分析在转染量达到最高，因此我们后续就采用48h上清进行淋巴细胞刺激实验，CCK8检测显示VAP和VAP2上清增殖明显高于对照组。

图1 淋巴细胞刺激试验

2.4 CS/VAP、VAP2纳米颗粒的体内生物学活性

图2 免疫小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a含量的变化

2.4.1 小鼠体重变化

注射后0～28d各组小鼠体重均曾上升趋势。两实验组小鼠生长速度均高于对照组（P＜0.05）。VAP、VAP2两组小鼠生长并无明显差异（P＞0.05）。

2.4.2 免疫小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a含量测定

如图2所示，实验组小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a水平均均明显高于对照组（P＜0.05）。IgG1与IgG2a的比值较对照组呈下降趋势，说明纳米颗粒更倾向于诱导小鼠的细胞免疫。A.IgG含量,B.IgG1含量,C.IgG2a含量,D.IgG1与IgG2a比值

2.4.3 CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的检测

如图3所示，实验组CD4+和CD8+T淋巴细胞含量均显著高于对照组（P＜0.05），且较对照组CD4+/CD8+比值均有不同程度的上升，最后趋近于2。说明免疫接种后细胞调节和细胞免疫机能显著提高。

图 3 接种小鼠血液中CD4+和CD8+T细胞的变化

2.4.4 TLRs基因的表达情况

如图4所示，在接种后7～28d，与对照组相比较，VAP和VAP2免疫小鼠TLR1,TLR4以及TLR9表达水平显著升高（P＜0.05），且 VAP2组显著高于 VAP组（P＜0.05）。免疫接种小鼠TLRs基因表达量的上升说明VAP和VAP2纳米颗粒有利于机体有效识别感染病原分子，促进先天免疫快速应答反应。

2.4.5 免疫前后细胞因子相关基因的表达情况

如图5所示，在接种后7～28d，与对照组相比较，VAP、VAP2免疫小鼠IL-2,IL-4,IL-23,IFN-r基因的表达水平显著升高，VAP2组显著高于VAP组（P＜0.05）。说明说明VAP、VAP2纳米颗粒能够促进免疫细胞的活化，促进多种细胞因子的表达，且新型抗菌肽基因和白细胞介素2融合表达载体的免疫调节疗效果更为明显。

图4 接种小鼠血液免疫细胞的 TLRs基因表达变化

图5 接种小鼠血液免疫细胞中IL-2,IL-4,IL-23和IFN-r基因表达变化

2.4.6 小鼠攻毒实验结果

图 6 小鼠攻毒后存活率

如图6所示，用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌攻毒后，注射VAP和VAP2纳米颗粒的两组小鼠均存活且没有出现细菌感染所引起的任何损害或症状。然而，对照组呈现了严重的细菌感染，80%的小鼠死于感染和损伤。对死亡小鼠进行解剖发现有明显的肠系膜毛细血管肿大、充血、发黑，脾脏、肝脏发黑。取腹腔积液涂平板，革兰氏染色发现致死菌是金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌。

3 讨论

白细胞介素2是白介素家族中重要的一员，主要由TH细胞和NK细胞分泌产生。IL-2与其特异性受体相结合激活下游信号通路，能够诱导NK细胞、单核细胞的增殖以及CTL的活化。此外，IL-2可刺激迟发型超敏反应，介导细胞免疫反应。有研究表明，IL-2作为一种新的免疫佐剂，既能避免常规佐剂的不良反应，又能增强病毒、细菌和寄生虫疫苗的免疫效果，提高抗体的均匀性，延长疫苗的保护时间，减少某些疫苗的副作用（Hossein et al.,2008）。

抗菌肽具有分子量小、水溶性好、热稳定性好、抗菌谱广等特点（Kamysz et al.,2005）。 抗菌肽的作用机制与阻断大分子生物合成的抗生素完全不同，它是通过作用于细菌细胞膜和DNA而导致细胞膜穿孔，内容物漏出，破坏细胞代谢途径，并联合DNA来抑制细胞复制和分裂，具有直接杀菌活性（Lohner K et al.,2005）。此外，抗菌肽具有多种免疫活性，能趋化中性粒细胞等免疫反应细胞，诱导多种白细胞介素、肿瘤坏死因子以及生长因子的表达（Pieter S et al.2016）。

迄今为止，已发现猪体内有30多种抗菌肽（You-Ting et al.2016）,研究表明，它们不仅具有广谱抗菌活性和免疫调节功能，而且对真核细胞具有独特的作用机制以及低毒性（Xu et al.2015）。 因此作为一种新的、安全的抗菌免疫调节剂，是一种理想的抗生素替代品。

壳聚糖是一种含有天然生物多糖甲壳素的脱乙酰基衍生物，具有良好的生物相容性（Prodpran et al.2007）。 它可被多种酶降解并且降解产物安全无毒，可被机体完全吸收（Zamani et al.2007）。由于其独特的结构特点，有研究结果表明，它作为缓释材料具有不可估量的潜力（Baek et al.2008）。近年来，壳聚糖作为一种非病毒基因载体已被许多研究小组广泛研究。含有治疗基因或siRNA的壳聚糖/脱氧核糖核酸（CS/DNA）微粒被用于体内和体外转染哺乳动物细胞（Mao et al.2010;Techaarpornkul et al.2010;Klausner et al.2010）。经过大量研究表明，壳聚糖可以包裹DNA形成小尺寸的纳米颗粒，能有效地携带基因进入靶细胞（Caifeng et al.2016）。

本实验将CAMPS以及猪白细胞介素2融合用于构建CAMPS-2A-IL2（VAP2）。随后将重组质粒用壳聚糖包裹并转染HEK293细胞，同时利用转染HEK293后48h的细胞上清液刺激猪外周血淋巴细胞，进行淋巴细胞活性实验。接着将纳米颗粒注入4周龄昆明小鼠体内通过采集尾静脉血检测目的基因的生物学活性。

体外实验结果表明，与对照组pVAX1相比较，两实验组均能显著促进猪淋巴母细胞增殖（P＜0.05）。流式以及酶联免疫吸附实验结果也表明两实验组小鼠血清中CD4+,CD8+以及 IgG,IgG1,IgG2a的水平都要明显高于对照组（P＜0.05），并且两实验组相比较，注射VAP2的A组要高于注射VAP的B组（p＜0.05）,这表明接种VAP2质粒的小鼠体液免疫功能有显著提高。此外，IgG1/IgG2a比值的下降表明接种VAP2质粒的小鼠更易诱导细胞免疫反应。

同样的，定量结果表明两实验组TLR1,TLR4，TLR9，IL-2，IL-4，IL-23和IFN-r基因的表达水平要明显高于对照组（P＜0.05），同时VAP2组明显高于VAP组（p＜0.05）。这表明VAP以及VAP2重组质粒纳米颗粒能够提高小鼠的先天免疫和免疫调节水平，增强机体的防御能力，并且与VAP相比，VAP2更为有效。通过用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌攻毒后发现，注射VAP和VAP2纳米颗粒的两组小鼠均存活且没有出现细菌感染所引起的任何损害或症状。然而，对照组出现了严重的细菌感染，大部分小鼠死于感染和损伤。

这些研究结果表明融合抗菌肽基因与白细胞介素2共表达可诱导动物产生更好的先天性免疫和适应性免疫。从而增强机体对病原体感染的协同免疫防御作用，为今后开发和应用新型的、经济实用的免疫调节剂来控制和预防动物疾病提供了新的思路。

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