谢传美，袁国华

（川北医学院附属医院 风湿科，四川 南充 637000）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性系统性自身免疫病，目前从遗传角度探索RA的发病机制成为研究热点。microRNA（miRNA）是一类内源性的小分子RNA，广泛参与各种生理及病理过程[1-2]。miRNA可调节免疫应答，参与多种自身免疫病的发病[3-8]。miR-146、miR-155及 miR-233等与RA关系密切[9]。miR-146的单核苷酸多态位点（single nucleotide polymorphism，SNP）rs2910164与自身免疫病相关[10-14]。miR-499a的rs3746444位点与RA相关[15-16]。中国人群miR-196a的rs11614913和miR-149的rs2292832位点与肿瘤及呼吸道疾病的易感性相关。本实验探讨以上位点与中国汉族人群RA患病风险的相关性。

1　资料与方法

1.1　一般资料

选取2014年7月-2017年1月在川北医学院附属医院风湿科住院的RA患者600例作为RA组，所有患者符合2009年美国风湿病学会和欧洲抗风湿联盟的ACR-EULAR分类标准[17]。收集并统计RA患者临床参数：年龄、性别、发病年龄、病程、红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、DAS28评 分（disease activity score，DAS）、关节X射线分期、类风湿因子（rheumatoid factor，RF）滴度及抗环状瓜氨酸抗体（anti-cyclic cirullonated peptide antibody，anti-CCP）滴度。随机选取本院体检中心健康体检者398例作为对照组，对照组符合以下标准：①本人及其直系亲属无自身免疫疾病病史，且不符合RA诊断标准中的任意一项；②无严重疾病史；③近期1个月未使用激素和免疫抑制剂等药物。本文中的研究对象均为无血缘关系汉族人。本研究获得本院伦理委员会批准，实验遵循赫尔辛基宣言，所有受试者自愿参加并签署知情同意书。

1.2　全血细胞基因组DNA的提取与分型

所有研究对象抽取2 ml外周静脉血置于EDTA抗凝管中，采用北京天根科技公司的Relax Gene Blood DNA系统提取所有样本的基因组DNA。采用基于连接酶检测反应（ligase detection reaction，LDR）的SNP分型技术（上海翼和应用生物技术有限公司）对所有样本的4个SNP位点进行基因分型。简要流程如下：①通过多重PCR技术获得含有待检测突变位点的基因片段；②通过多重LDR技术进行基因分型检测；③最后通过测序仪电泳读取检测结果。

为确保实验质量，笔者在分型中使用双重阳性对照（相同DNA样本的重复）和阴性对照（空白，不含DNA样本）。SNP和样本分型正确率＞95%时方可进入下一步实验流程。

1.3　统计学方法

使用SNPStats软件分析基因分布是否符合哈迪-温伯格平衡定律（hardy-weinberg equilibrium，HWE）。正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，非正态分布计量资料以中位数和四分位数间距M（P25，P75）表示，用t检验、方差分析或非参数检验，计数资料以率表示，采用χ2检验或Fishers确切概率法。本研究采用广义多因子降维法（generalized multifactor dimensionality reduction，GMDR）分析各变量间的组合并判读较好的模型，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　两组患者一般资料、等位基因及基因型频率比较

RA组患者中男性134例，女性466例；平均年龄（41.4±5.9）岁；病程1.5～10.0年，平均4.0年。其中RF阳性、anti-CCP阳性、关节X射线分期＞Ⅱ期及DAS28评分＞3.2分者分别为70.5%、85.6%、47.2%和82.4%。平均ESR水平为23.8 mm/h（16.1～33.1 mm/h），平均CRP水平为7.8 mg/L（3.5～25.0 mg/L）。对照组患者中男性78例，女性320例；平均年龄（38.5±9.8）岁。两组患者年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。在本研究中，所有SNP位点的分型成功率均＞98%，4个位点均显示出2个等位基因及3个基因型。对照组HWE检验显示，符合HWE定律。两组rs2910164、rs3746444、rs2292832及rs11614913等位基因和基因型频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、2。

2.2　rs2910164、rs3746444、rs2292832 及rs11614913位点在不同遗传模型下与RA比较

在不同遗传模型下均未发现rs2910164、rs3746444、rs2292832及rs11614913与RA遗传易感性相关（P＞0.05）。见表3～5。

2.3　CRP、ESR及DAS28评分与RA患者基因型频率分布的关系

笔者采用CRP、ESR水平及DAS28评分评价RA的疾病活动度。通过比较4个位点不同基因型的CRP、ESR水平及DAS28评分，发现rs3746444位点与RA疾病活动性存在关联，TT、TC及CC基因型的CRP水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步分析基因型间的CRP水平发现，TT基因型与TC基因型比较，差异有统计学意义（Z=-3.365，P=0.001）；TT基因型与CC基因型比较，差异无统计学意义；TC基因型与CC基因型比较，差异有统计学意义（Z=-2.098，P=0.036）。TT、TC及CC基因型的ESR水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），进一步分析基因型间的ESR水平发现，TT基因型与TC基因型比较，差异有统计学意义（Z=-2.201，P=0.028）；TT基因型与CC基因型比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；TC基因型与CC基因型比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。TT、TC及CC基因型的DAS28评分比较，差异有统计学意义（P＜0.05），进一步分析基因型间的DAS28评分发现，TT基因型与TC基因型相比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；TT基因型与CC基因型比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；TC基因型与CC基因型比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表6、图1。

2.4　RA的疾病严重程度和基因型频率分布的关系

笔者使用RF、CCP和X射线分别表示RA的疾病严重性。研究结果发现rs3746444位点与RA的疾病严重性存在关联，TT、TC和CC基因型的RF比较，差异有统计学意义（P＜0.05），进一步研究发现TC基因型与TT＋CC基因型比较，差异有统计学意义（P＜0.05），RF阳性组的患病风险增加。TT、TC和CC基因型的anti-CCP比较，差异有统计学意义（P＜0.05），进一步研究发现TC基因型与TT＋CC基因型比较，差异有统计学意义阳性组的患病风险增加。同样，TT、TC和CC基因型的X射线分期≤Ⅱ期比较，差异有统计学意义（P＜0.05），TC基因型与TT＋CC基因型比较，差异有统计学意义[OlR=1.572（95%CI：1.084，2.279）P=0.017]，anti-CCP阳性组的患病风险增加。见表7～9。

表1　两组患者基因型分布情况比较　例（%）

表2　各位点等位基因型的分布情况　例（%）

2.5　基因-基因相互作用和RA风险的广义多因素降维模型分析

通过GMDR 0.9软件进行多因子降维分析microRNA基因-基因交互作用与RA风险的相关性。列出3个不同组合的最佳模型，模型间训练精确度、测试精确度及10次拟合的交叉验证一致性（crossvalidation consistency，CV）比较，差异无统计学意义（P＞0.05），未发现4个位点之间的交互作用与RA患病风险相关。见表10。

2.6　基因-性别相互作用和RA风险的广义多因素降维模型分析

通过GMDR 0.9软件进行多因子降维分析microRNA基因-性别交互作用与RA风险的相关性。列出4个不同组合的最佳模型，模型间的训练精确度、测试精确度及10次拟合的CV比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。rs11614913-SEX构成的组合符号训练精准度、测试精准度及拟合的CV都较高，并且仅包含2个因子，符合简约的原则。因此为最佳交互作用模型。见表11。

表3　显性模型下SNP与RA的关系　例（%）

表4　隐性模型下SNP与RA的关系　例（%）

表5　超显性模型下SNP与RA的关系　例（%）

表6　RA患者基因型频率分布与CRP、ESR及DAS28评分的关系

图1　RA患者CRP、ESR和DAS28评分与rs3746444基因型频率分布的关系

表7　基因型频率分布与RA组患者RF的关系　例（%）

表8　基因型频率分布与RA组患者anti-CCP抗体的关系　例（%）

续表8

表9 基因型频率分布与RA组患者X线分期的关系　例（%）

续表9

表10　基因-基因相互作用和RA风险的广义多因素降维模型分析

表11　基因-性别相互作用和RA风险的广义多因素降维模型

3　讨论

类风湿关节炎是一种常见的、多种因素诱导的全身性自身免疫病，其中遗传因素提供了个体发病的易感性。miRNA属于表观遗传学的范畴，许多研究发现miRNA参与了自身免疫病和炎症性疾病的发生发展过程。因此，基于miRNA基因改变能够影响其表达及功能的设想，笔者选择了中国人群中常见的SNP位点rs2910164、rs3746444、rs11614913及rs2292832探讨和RA遗传易感性的关联。

在本研究中，笔者并未发现rs2910164、rs11614913及rs2292832和RA患病风险及疾病的活动性及严重性相关。人类miR-146a基因位于第5号染色体，许多研究显示miR-146a在免疫系统中发挥了重要功能，特别是可以靶向抑制白细胞介素-1受体相关激酶、TNF受体相关因子6参与Toll样受体/髓样分化因子88（以下简称TLR/MyD88）信号通路的调控，进而影响核转录因子NF-κB（nuclear transcription factorκB，NF-κB）下游的白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎症细胞因子的产生。许多研究提示，以上炎症细胞因子可以诱导miR-146a在免疫细胞、滑膜成纤维细胞、滑膜组织中表达增加，或许和RA疾病的活动性相关[18-20]。rs2910164位点位于pre-miR-146a的负链序列，其突变可以导致pre-miR-146a发夹结构茎部由G∶U配对变成C∶U错配，影响成熟miR-146a表达和功能，该位点多态性可能和miR-146a参与的疾病遗传易感性有关[21]。然而，目前关于此位点与RA患病风险的结论报道不一。国内外均有文献报道，该位点的多态性与RA患病风险无关[15，22]。类似的，在本研究中，无论是从RA的患病风险，还是与RA的疾病活动性及严重性方面，均未发现相关性。这些结果提示，rs2910164位点并不能影响miR-146a在TNF-α信号通路中的作用，miR-146a在RA中发挥作用的机制可能与该位点多态性无关。rs2292832位点位于miR-149的前体，它能负反馈调节TLR介导的免疫反应过程。有研究提示miR-149可能是TLR/MyD88信号通路的重要免疫调节因子，因为使用脂多糖刺激巨噬细胞系RAW264.7后，miR-149水平降低，而MyD88升高，TNF-α、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）等炎症介质产生亦减少[23]。miR-149在调节免疫反应中可能发挥了重要的作用，它能与MyD88的3’UTR直接结合，在转录后水平负反馈调节炎症因子的产生[24]。故有中国学者报道，基因型为CC的患者RA发病风险增大，即miR-149的rs2292832多态性位点与RA的遗传易感性相关[25]。但在本研究中并未发现该位点和RA易感性相关，出现此差异的可能性为前者研究样本量较小，且和分型技术的灵敏度及准确度有关。因此，此位点是否在RA中发挥作用，还有待进一步考量。miR-196a的rs11614913位点涉及多种肿瘤的致癌过程。有研究显示，该位点通过调控基因表达和调节促炎因子的产生，可以增加白塞病的发病风险[26]。然而，在本研究中，并未发现该位点和RA发病相关。

位于MIR499A基因的rs3746444位点目前发现与RA、溃疡性结肠炎及白塞病等多种自身免疫病相关[15-16，27]。值得注意的是，以上研究均发现CT基因型与疾病的相关性，提示超显性遗传模型在RA疾病发生发展中的重要作用。类似的，在本研究中，同样发现CT基因型与RA患者的临床参数之间存在相关性。笔者发现CT基因型的患者的CRP、ESR水平及DAS28评分均较TT、CC基因型的升高，这与前人的研究结果相一致，可能提示miR-499a与RA疾病活动相关。众所周知，RA是一种以侵蚀性关节炎为主要表现的全身性自身免疫病，可导致关节的畸形和毁损，因此在当今RA不能根治的情况下，治疗中评价RA疾病活动度，并进行及时有效的治疗对防止关节破坏，保护关节功能非常重要。国际上比较公认的评价RA疾病活动度的评分是DAS28，比较直观简便的方法是参考炎症相关指标，如CRP、ESR及血小板等。最新研究表明，CRP检测具有简单、确定、重复性好及不受年龄干扰的特点，单独测定CRP可能更适合评价疾病的活动性[28]。miR-499a的靶基因包括白细胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）受体B、IL-6以及其他细胞因子。IL-17是促炎症细胞因子，可以诱导TNF-α、IL-1β、IL-6、白细胞介素-23及粒细胞集落刺激因子等细胞因子的合成，而IL-6可以通过肝脏刺激CRP和血纤维蛋白原的合成[29]。因此，笔者推测MiR-499a可以促进CRP的合成，从而导致炎症的发展。

此外，在本研究中，笔者还发现rs3746444位点的CT基因型或许与RA疾病的严重性相关。其中RF阳性组和anti-CCP抗体阳性组的CT基因型频率均较阴性组升高，并且在X射线分期严重骨破坏组（＞Ⅱ期）中也升高。目前研究表明RF具有预后意义，因为有高滴度类风湿因子者关节病变更严重、进展更快且更容易出现关节外病变。anti-CCP抗体的敏感性与免疫球蛋白M型类风湿因子相似，但anti-CCP抗体的特异性更高。检测anti-CCP抗体有助于早期RA的鉴别诊断，而且对于确定那些有发生侵蚀性关节损害危险的早期RA患者也很有价值。这些都提示CT基因型的RA或许更容易进展为侵蚀性关节炎。有研究表明，miR-499a可以通过调节其靶基因PADI4的表达，从而对anti-CCP抗体的合成产生影响[22]。还有研究报道，IL-17诱导的一系列炎症因子，例如TNF-α、IL-1β，可以促进破骨细胞的激活和分化，也可以通过激活NF-κB配体受体催化剂，从而在破骨细胞的生成中发挥作用，进一步导致骨质的破坏和关节的炎症[30]。因此，笔者推测miR-499a和侵蚀性RA存在一定的关联。

前已述及，RA是由多因素诱导的复杂疾病，遗传因素提供了个体发病的易感性，但却不是疾病发生发展的唯一性因素。环境因素对RA的影响也较为显著。因此，研究多个遗传因素、环境因素，以及遗传因素和环境因素间的交互作用对RA的影响显得十分重要。

多因子降维分析法（Multifactor dimensionality，MDR）是一种非参数、无需遗传模式的分析方法，它的主要特点是把高维的位点组合分成高危和低危2类，降低了数据的维数，并通过交叉验证来检验模型。最后得到的结果是一组模型，每一个模型是从一个特定交互级别（l阶、2阶及交互作用）中选取最优的。该方法不仅适用于病例对照的研究设计，而且可应用于复杂疾病的交互作用分析。以MDR方法为基础，LOU等[31]学者发展了GMDR，与MDR相比较，GMDR采用基于广义线性回归的积分的统计方法，代替了MDR中的高危和低危分类，可处理计量和计数资料，同时允许调整协变量。这种方法和MDR丢失大量信息的降维方法不同，从而把握度也得到提高。本研究对上述4个基因的4个SNP位点用GMDR的方法进行了交互分析，结果显示并未发现4个位点之间的交互作用与RA患病风险相关。然而，在基因-性别之间交互作用与RA风险的分析当中，结果显示rs11614913-SEX构成的组合符号检验有差异，且训练精准度、测试精准度以及交叉一致性都较高，并且仅包含两位点符合简约的原则。因此为最佳交互作用模型，与RA发病有关，它们之间的调控机制可能参与了RA疾病的发展进程，然而这些推测都需要得到进一步的证实。

综上所述，本研究发现rs3746444（miRNA-499a）位点与中国汉族人群RA疾病的活动性和严重性相关，并且rs11614913位点（miR-196a）与性别之间存在交互作用，可能与RA发病有关。这些发现有待在更广泛的样本中得到证实。

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