吴遥西，李浩勇，周治彦，陈金火，李琦，马哲，金应霞，梁培育

（1.海南医学院第一附属医院 泌尿外科，海南 海口 570102；2.武汉大学人民医院 泌尿外科，湖北 武汉 430060；3.武汉大学人民医院 中心实验室，湖北 武汉 430060）

膀胱癌是最常见的泌尿系统肿瘤[1]，寻找有效的治疗靶点是研究热点之一。已有研究证明，膀胱癌组织细胞能表达免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG），并与细胞生长和凋亡有关[2-6]。CHEN等[7]发现，在多种癌细胞中，IGHG1基因表达与肿瘤来源的IgG呈正相关。为明确肿瘤来源IgG对膀胱癌细胞功能学的影响，本研究采用慢病毒载体RNA干扰（RNA interference，RNAi）方法沉默膀胱癌EJ细胞的IGHG1基因，降低肿瘤来源IgG的表达，探究EJ细胞增殖、凋亡及迁移的改变。

1　材料与方法

1.1　细胞与试剂

EJ细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）。胎牛血清、RPMI 1640、青霉素链霉素溶液和Trizol®Reagent购自美国Invitrogen公司，RIPA裂解液（强）、PMSF购自上海威奥生物科技有限公司，聚丙烯酰胺凝胶（上海威奥公司），PhosSTOP（美国F.Hoffmann-La Roche公司），小鼠抗人IgG重链单克隆抗体（英国Abcam公司），兔抗人Caspase-3单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司），小鼠抗人GAPDH单克隆抗体（北京康为世纪公司），荧光二抗（美国Li-COR公司），Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司），SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒（日本TaKaRa公司），CCK-8试剂盒（日本Dojindo公司），BD PharmingenTMPE Annexin V Apoptosis Detection试剂盒（美国BD Biosciences公司），LV-IGHG1-RNAi和阴性对照序列（negative scrambled，NC）慢病毒、Polybrene由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。其余试剂均为市售分析纯产品。

1.2　主要仪器

Applied Biosystems by Life Technologies 7500型实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 系 统（美国Thermo Fisher Scientific公司），Licor Odyssey双通道红外成像系统（美国Li-COR公司），BD FACSCalibur流式细胞仪（美国BD Biosciences公司），Perkin Elmer Victor 31420 Multilabel Counter酶标仪（美国PerkinElmer公司）。

1.3　细胞培养

未转染的EJ细胞、已稳定转染LV-IGHG1-RNAi的shIGHG1-EJ细胞，以及稳定转染NC基因的NC-EJ细胞用含10%胎牛血清和1%青霉素链霉素溶液的RPMI 1640培养基，放置于37℃、5%二氧化碳CO2环境中培养。实验用细胞培养至70%～80%细胞密度、处于增殖期的细胞，用胰酶消化后收集细胞进行相关实验。构建稳定沉默IGHG1基因的EJ细胞（shIGHG1-EJ细胞）作为实验组；将NC慢病毒载体感染EJ细胞，构建稳定转染NC序列的NC-EJ细胞作为阴性对照组；未转染膀胱癌EJ细胞作为空白对照组。

1.4　方法

1.4.1慢病毒的构建GenBank查获人IGHG1（Gene ID：3500）mRNA序列，设计19 bp的IGHG1-RNAi正向引物：5’-AGTGCAAGGTCTCCAACAA-3’，反向引物：5’-TTGTTGGAGACCTTGCACT-3’；NC正向引物 ：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反向引物 ：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。LV-IGHG1-RNAi和NC慢病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司制备，慢病毒载体（GV248）由荧光标记包装，病毒滴度3×108TU/ml。

1.4.2构建稳定转染的shIGHG1-EJ和NC-EJ细胞将EJ细胞以5×104个/孔接种于6孔板，分为实验组和阴性对照组，细胞贴壁后将20μl/孔LVIGHG1-RNAi或NC慢病毒溶液、0.5μl/孔Polybrene分别加入实验组和阴性对照组转染EJ细胞，转染18 h后更换1640完全培养基，继续转染至72 h，观察绿色萤光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达并计算感染率。

1.4.3qRT-PCR采用qRT-PCR检测细胞IGHG1的表达。设计GAPDH和IgG引物。GAPDH正向引物：5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGC-3’，反向引物：5’-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3’；IgG正向引物：5’-TCCAAGAGGAAACCGTAAC-3’，反向引物：5’-GACACTGGCAGAGGTGATT-3’。 用 Trizol提 取shIGHG1-EJ、NC-EJ和EJ细胞的总RNA，按Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis试剂盒说明书操作步骤逆转录cDNA。按SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒说明书，加入相应引物的反应体系，用qRT-PCR系统检测 Ct值。使用 2-ΔΔCt法分析 shIGHG1-EJ、NC-EJ和EJ细胞IGHG1 mRNA的相对表达量，不同时间重复3次。

1.4.4Western blot检测采用 Western blot检测IgG、Caspase-3和Caspase-3剪切片段蛋白的表达。消化并收集shIGHG1-EJ、NC-EJ和EJ细胞，加入RIPA、PhosSTOP和PMSF，按100∶4∶1比例配制蛋白裂解工作液，冰上提取总蛋白，检测蛋白浓度，取100μg蛋白样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转膜、封闭2 h，加入相应稀释倍数的一抗4℃过夜，洗膜后加入1∶15 000稀释倍数的对应荧光二抗室温孵育2 h。用双通道红外成像系统检测杂交信号，用Image J软件检测IgGγ和GAPDH的相对表达量，实验重复3次。

1.4.5CCK-8法采用CCK-8法检测细胞增殖功能。消化并收集shIGHG1-EJ、NC-EJ和EJ细胞，以5×103个/孔接种于96孔板中培养，分别于0、6、12、24和 48 h加 入 10μl/孔 CCK-8试 剂，置于37℃恒温箱反应3 h后，用酶标仪检测各孔在450～490 nm处光密度（optical density，OD）值，以平均OD值表示细胞增殖数量，实验重复3次。

1.4.6流式细胞术（flow cytometry，FCM）采用FCM检测细胞凋亡。消化并收集shIGHG1-EJ、NC-EJ和EJ细胞，以1×105个/孔接种于6孔板中培养。贴壁后更换培养基继续培养48 h，胰酶消化后收集细胞，按BD PharmingenTMPE Annexin V Apoptosis Detection试剂盒说明书操作，加入100μl 1×Bingding Buffer重悬细胞，并加入 Annexin-V-PE和7-AAD各5μl，室温避光15 min后再加入400μl 1×Bingding Buffer，并使用流式细胞仪检测并分析细胞凋亡，实验重复3次。

1.4.7细胞的迁移功能测定将shIGHG1-EJ、NC-EJ和EJ细胞接种于6孔板中，待细胞生长＞80%时在中央划痕，用PBS洗去划下细胞后,在RPMI 1640无血清培养基中培养，用倒置显微镜观察0、8和24 h细胞的迁移情况并拍照，用Image J软件对迁移细胞进行分析，实验重复3次。

1.5　统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　验证稳定转染的shIGHG1-EJ和NC-EJ细胞

EJ细胞感染LV-IGHG1-RNAi或NC慢病毒72 h后，荧光显微镜下观察，有绿色荧光蛋白GFP表达的细胞即为成功转染的shIGHG1-EJ细胞（实验组）和NC-EJ细胞（阴性对照组），实验组的转染率为（76.667±0.042）%，阴性对照组为（75.333±0.055）%（见图1A）。shIGHG1-EJ、NC-EJ和 EJ细 胞 的IGHG1 mRNA表达量比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=630.167，P=0.000），shIGHG1-EJ细胞为EJ细胞的（2.473±0.901）%，NC-EJ细胞 为 EJ细 胞 的（85.631±7.875）%，shIGHG1-EJ细胞IGHG1 mRNA表达量降低（见图1B）。shIGHG1-EJ、NC-EJ和EJ细胞的IgGγ蛋白表达量分 别 为（2.842±0.013）%、（18.023±0.023）% 和（18.209±0.121）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=30 603.431，P=0.000），shIGHG1-EJ细胞较 EJ细胞降低（P＜0.05）；NC-EJ细胞与 EJ细胞比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见图1C）。

2.2　细胞增殖

比 较 shIGHG1-EJ、NC-EJ和 EJ细胞在0、6、12、24和48 h的OD值，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的OD值有差别（F=11766.959，P=0.000）；② 3组 的 OD值 有差别（F=59.646，P=0.000），实验组的OD值较低，提示shIGHG1-EJ细胞增殖受抑制，沉默IGHG1基因抑制细胞增殖；③各组的OD值变化趋势有差别（F=10.118，P=0.000）。见表1和图2。

图1　稳定转染的shIGHG1-EJ和NC-EJ细胞

表1　3组不同时间时点OD值比较　（±s）

表1　3组不同时间时点OD值比较　（±s）

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图2　3组不同时间点OD值变化趋势

表2　3组细胞凋亡率比较　（%，±s）

表2　3组细胞凋亡率比较　（%，±s）

?

2.3　细胞凋亡

3组晚期凋亡率（upper right，UR）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；3组早期凋亡率（lower right，LR）及总凋亡率（LR+UR）比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组细胞凋亡率较空白对照组高，表现为细胞早期凋亡，提示沉默IGHG1基因促进细胞凋亡。阴性对照组与空白对照组凋亡率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示转染携带NC慢病毒对细胞凋亡无明显影响（见表2和图3）。Western blot检测结果表明，实验组出现明显的Caspase-3剪切片段，提示沉默IGHG1基因诱导细胞凋亡增多（见图4）。

2.4　细胞迁移能力

空白对照组、阴性对照组、实验组的24 h迁移细胞数分别为（694±14）、（683±13）和（246±65）个，经方差分析，差异有统计学意义（F=120.316，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，实验组迁移细胞数仅为空白对照组的36%（P＜0.05），提示沉默IGHG1基因抑制细胞迁移；阴性对照组与空白对照组24 h细胞迁移数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示转染携带NC慢病毒对细胞凋亡无明显影响。见图5。

图3　细胞凋亡情况

图4　Caspase-3和Caspase-3剪切片段蛋白的表达

图5　细胞迁移能力

3　讨论

最新统计调查显示，膀胱癌居我国男性肿瘤发病率的第7位[8]。针对膀胱癌的诊断、治疗和特异性靶向治疗一直是热门研究。有研究表明，免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）能表达于多种上皮来源的肿瘤细胞（肝癌、肺癌、乳腺癌和直肠癌等）及部分正常的上皮细胞（肺组织）[7-10]。WAN等[11]近期研究发现，不仅在人胰腺癌细胞中可以检测到IgG的表达，而且胰腺表达IgG还与糖尿病的发病有关；JIANG等[9]在肺癌组织中也有相同发现。上述研究均表明，肿瘤来源的IgG对癌细胞的增殖和生长具有一定促进作用，在正常细胞中，IgG的表达增多可能是导致疾病发生、发展的因素之一。

CHEN等[7]研究发现，在多种癌细胞系中均能检测到IGHG1恒定区基因和肿瘤来源的IgG蛋白表达，Igγ1链恒定区能被肿瘤细胞的IGHG1基因编码并表达。可以认为IGHG1编码IgGγ1链恒定区与肿瘤来源IgG蛋白的合成有直接关系。PAN等[12]研究报道，在抑制IGHG1基因后，前列腺癌细胞的增殖受抑制，同时前列腺癌细胞凋亡增加。因此，在肿瘤细胞中，IGHG1编码IgGγ1链恒定区，参与IgG蛋白的表达，从而促进肿瘤的增殖，抑制细胞凋亡。

本研究表明，针对EJ细胞进行IGHG1基因特异性沉默后，构建了稳定沉默IGHG1基因的shIGHG1-EJ细胞作为实验组，以及稳定转染NC基因序列的NC-EJ细胞作为阴性对照组。另外，将未转染的膀胱癌EJ细胞作为空白对照组。qRT-PCR和Western blot检测结果表明，shIGHG1-EJ细胞的IgG mRNA和蛋白表达水平低于转染NC的NC-EJ细胞和野生型EJ细胞株。CCK-8法结果表明，与后2种细胞相比，shIGHG1-EJ细胞的48 h细胞增殖能力降低；细胞划痕实验表明，24 h细胞迁移能力也降低。同时FCM结果表明，IGHG1基因沉默后促进EJ细胞的凋亡，笔者通过Caspase-3及其剪切片段验证了细胞的凋亡。可以认为这些膀胱癌EJ细胞功能学的改变可能与肿瘤来源的IgG表达降低有关。

IgG可以在多种细胞中检测到。在泌尿系统肿瘤中，膀胱癌组织和细胞的IgG表达高于正常尿路上皮组织。笔者通过针对IGHG1基因进行特异性沉默后，检测膀胱癌EJ细胞功能学的改变，发现肿瘤来源IgG表达与EJ细胞功能学具有明显的相关性，与细胞凋亡呈负相关，因此，笔者推测IgG可以成为膀胱癌靶向治疗的一个有效靶点。针对肿瘤来源的IgG或IGHG1基因靶向治疗可以促进肿瘤细胞的凋亡。

在生理状态下，活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶（activated—induced cytidine deaminase，AID）是一种由B细胞表达的诱导基因高度突变（somatic hypermutation，SHM）和免疫球蛋白基因的类别转换重组蛋白。而重组活化基因-1（recombination activating gene，RAG-1）和重组活化基因-2（RAG-2）则是免疫球蛋白进行Ig VH基因重排和修饰表达的重要酶，在AID作用的下游增强免疫系统抗体表达的多样性[13]，RAG-1和RAG-2是合成IgG的关键酶，因此AID的高表达刺激RAG-1和RAG-2表达活跃，可能是导致肿瘤细胞IgG表达增多的因素之一。

CASCALHO[14]研究发现，AID是一个与基因诱导突变相关的酶，涉及DNA/RNA编辑的酶，其能将胞嘧啶转化成尿嘧啶，通过修改靶基因的序列，从而产生对人体各种有利的作用和效应。生理状态下为维持内环境和遗传信息的稳定，细胞具备基因突变和修复核苷酸序列改变的体系，从而避免所谓“体细胞突变”，如SHM，产生有害的单个核苷酸改变。但是癌细胞常由基因突变导致，同时癌细胞在转化过程中也常获得大量的体细胞突变，此时在AID的过度表达下，有可能会影响基因表达而产生有害的突变；肿瘤细胞中IgG的过表达也是其影响之一[15]。

综上所述，AID作为与IgG表达有关的上游蛋白酶，很可能是引起肿瘤细胞IgG表达增加和促进肿瘤发生、发展的因素之一。接下来，一方面可以针对膀胱尿路上皮癌细胞IGHG1基因抑制和细胞凋亡的相关性进行进一步研究，从膀胱癌细胞IGHG1基因沉默和化疗药物的联合应用，进一步探讨该位点在抗肿瘤治疗中的可行性。另一方面，从AID开始探究肿瘤细胞中IgG表达升高的机制，以及从下游通路探寻其可能促进肿瘤细胞生长，抑制肿瘤细胞凋亡的机制，为尿路上皮肿瘤的靶向治疗提供更多依据。

参 考 文 献：

[1]SIEGEL R L, MILLER K D, JEMAL A. Cancer statistics, 2016[J].CA: A Cancer Journal for Clinicians, 2016, 66(1): 10-29.

[2]LIANG P Y, LI H Y, ZHOU Z Y, et al. Overexpression of immunoglobulin G prompts cell proliferation and inhibits cell apoptosis in human urothelial carcinoma[J]. Tumor Biology, 2013,34(3): 1783-1791.

[3]SHENG Z, SHENG Z, LIU Y, et al. Involvement of cancer-derived IgG in the proliferation, migration and invasion of bladder cancer cells[J]. Oncology Letters, 2016, 12(6): 5113-5121.

[4]李浩勇, 梁培育, 朱孝峰, 等. 免疫球蛋白G在膀胱癌细胞中的表达及其抗体诱导肿瘤细胞凋亡的研究[J]. 中国病理生理杂志, 2007, 23(6): 1068-1073.

[5]梁培育, 李浩勇, 欧善际, 等. 反义IgG寡核酸诱导膀胱肿瘤细胞T24凋亡及其增强丝裂霉素敏感性的研究[J]. 中华实验外科杂志, 2008, 25(12): 1681.

[6]梁培育, 李浩勇, 欧善际, 等. 抗人IgG抗体与丝裂霉素联合应用治疗膀胱癌的实验研究[J]. 中华泌尿外科杂志, 2008, 29(12):804-807.

[7]CHEN Z, GU J. Immunoglobulin G expression in carcinomas and cancer cell lines[J]. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 2007,21(11): 2931-2938.

[8]CHEN W, ZHENG R, BAADE P D, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 2016, 66(2):115-132.

[9]JIANG C, HUANG T, WANG Y, et al. Immunoglobulin G expression in lung cancer and its effects on metastasis[J]. PLoS One, 2014, 9(5): DOI: 10.1371/journal.pone.0097359.

[10]HUANG J, SUN X, GONG X, et al. Rearrangement and expression of the immunoglobulin μ-chain gene in human myeloid cells[J]. Cellular & Molecular Immunology, 2014, 11:94-104.

[11]WAN X, LEI Y, LI Z, et al. Pancreatic expression of immunoglobulin G in human pancreatic cancer and associated diabetes[J]. Pancreas, 2015, 44(8): 1304-1313.

[12]PAN B, ZHENG S, LIU C, et al. Suppression of IGHG1 gene expression by siRNA leads to growth inhibition and apoptosis induction in human prostate cancer cell[J]. Molecular Biology Reports, 2013, 40(1): 27-33.

[13]MAUL R W, GEARHART P J. AID and somatic hypermutation[J].Advances in Immunology, 2010, 105: 159-191.

[14]CASCALHO M. Advantages and disadvantages of cytidine deamination[J]. Journal of Immunology, 2004, 172(11):6513-6518.

[15]ZAN H, CASALI P. Regulation of Aicda expression and AID activity[J]. Autoimmunity, 2012, 46(2): 83-101.