韩峰，颜楠，李侠，费舟

[空军军医大学附属医院（西京医院） 1.神经外科，2.检验科， 陕西 西安 710032]

创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）具有发生率高、致残率高、死亡率高、治愈率低的特点[1-3]。TBI严重威胁人类健康，是影响人类幸福生活的重要原因。如今，药物治疗TBI一直是国内外学者研究的热点[4-6]。三七是我国传统的中药，始载于《本草纲目》，因“其叶左三右四，故名三七”而得名[7-8]。三七的主要的活性成份是三七总皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）。研究表明，PNS对神经元细胞损伤具有保护作用[9]，但其具体作用机制还不是很清楚。本研究利用过氧化氢H2O2刺激HT22细胞，建立体外神经细胞抗氧化刺激模型，研究PNS对HT22细胞的保护作用，阐明其抗氧化损伤的作用机制，为临床应用提供实验依据。

1　材料与方法

1.1　主要试剂与仪器

1.1.1试剂PNS（成都华高药业有限公司），海马神经元HT22细胞株（空军军医大学附属医院全军神经外科研究所）。胎牛血清、1640培养基、0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司，CCK-8试剂盒（批号：CK04-1000T）（日本 Dojindo公司），青霉素、链霉素购自美国Sigma公司，乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）（南京建成生物工程研究所）。

1.1.2仪器微孔酶联检测仪（美国伯乐公司），Leica倒置荧光显微镜（德国莱卡相机股份有限公司）。

1.2　方法

1.2.1HT22细胞培养HT22细胞在含10%胎牛血清、1640培养基中，置于37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中培养，取对数生长期细胞，0.25%胰蛋白酶消化传代培养，进行后续实验研究。

1.2.2H2O2模型的建立取培养对数期HT22细胞，胰酶消化，制备单细胞悬液，计数并接种细胞1×105个/ml于96孔板，细胞贴壁后，分别加入0、50、100、200、400和800μmol/L H2O2溶液刺激24 h，加入CCK-8 10μL/孔，37℃培养箱孵育1～4 h。在酶联检测仪450 nm处读取光密度值（optical density，OD），实验重复3次。细胞活性（%）=[OD加药-OD空白]/[OD0加药-OD空白]×100%。

1.2.3PNS对HT22的保护接种细胞于96孔板，每组设6个复孔，贴壁后加入0.00、0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 mg/L PNS作用24 h后进行CCK-8法检测，实验重复3次。

1.2.4PNS对氧化应激HT22细胞活性的影响取培养对数期细胞，调整细胞密度至1×105个/ml，接种于96孔板。分别设空白对照组、对照组（正常细胞培养HT22），模型组（H2O2500μmol/L），同时模型组在分别加入不同浓度（0.00、0.01、0.10、1.00、10.00和100.00 mg/L）PNS作用2 h后，再换500μmol/LH2O2作用24 h，进行CCK-8法检测，在450 nm处读取OD值，实验重复3次。

1.2.5细胞形态学观察取对数生长期HT22细胞进行计数后接种于6孔板，当细胞密度汇合至75%时，加入10 mg/L PNS作用2 h，加入500μmol/L H2O2损伤细胞，用相差显微镜观察并拍摄细胞形态。

1.2.6LDH的释放收集细胞上清液，按LDH说明书进行操作，检测细胞损伤过程中细胞的凋亡和LDH的释放，而活细胞没有该功能。细胞LDH释放率（%）=细胞培养基中测定的酶活性单位/（细胞裂解液测定的酶活性单位+细胞培养基测定的酶活性单位）×100%。数值越大，表明细胞活性越差，细胞损伤程度越高。

1.2.7流式细胞术分别设对照组、模型组（H2O2处理组）和PNS+H2O2组，收集各组细胞悬液，调整细胞密度至1×106个/ml，磷酸盐缓冲溶液清洗2次。按照Annexin V FITC试剂盒说明书进行操作，分别加入10μl Annexin V–FITC和5μl PI轻柔振荡混匀，4℃避光反应30 min，用流式细胞仪定量分析细胞凋亡水平。

1.3　统计学方法

数据分析采用SPSS 12.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较用方差分析，方差齐则两两比较用Dunnett-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　H2O2对HT22细胞生长活性的影响

各组HT22细胞生长活性比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=108.257，P=0.0378），不同浓度的H2O2对HT22细胞增殖的影响不同。进一步两两比较经Dunnett-t检验，50和100μmol/L H2O2对HT22细胞无明显抑制效应（P＞0.05）；200、400和800μmol/L H2O2对HT22细胞诱导24 h后，损伤明显，抑制率分别达（16.277±3.315）%、（35.043±4.342）%和（73.583±3.403）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.2　不同浓度PNS对HT22细胞活性的影响

各组HT22细胞生长活性比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=18.422，P=0.025），不同浓度PNS对HT22细胞均有保护作用，且伴随PNS浓度增加，HT22细胞无明显依赖性。在0.01～1.00 mg/L PNS作用下，HT22细胞增殖不明显（P＞0.05），而PNS在10.00 mg/L浓度时，能促进HT22细胞生长活性（P＜0.05）。当100.00 mg/L PNS作用HT22细胞时，具有抑制细胞增殖活性效应（P＜0.05）。见图2。

2.3　PNS对H2O2损伤后HT22细胞活性的影响

HT22细胞经500μmol/L H2O2作用后，细胞生长受抑制。各组HT22细胞生长活性比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=31.970，P=0.003）。当PNS对HT22预保护2 h后，发现0.10～10.00 mg/L PNS对H2O2损伤均具有保护作用，且浓度不同，保护程度不同，其中10.00 mg/L PNS的保护效果最显著（P＜0.05）。而PNS在100 mg/L时，对细胞无保护作用，反而经H2O2诱导后会加重细胞损伤，降低细胞活性。见图3。

2.4　PNS对H2O2损伤后HT22细胞LDH含量的影响

H2O2损伤HT22细胞后，出现大量的细胞裂解，细胞活性降低，导致LDH含量升高。不同浓度PNS对HT22细胞进行预保护后，各组LDH含量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=167.536，P=0.008），LDH 的释放均降低。 与 PNS+H2O2组（0.01～10.00 mg/L PNS）比较，随着PNS浓度增加，LDH含量逐渐降低。LDH检测结果显示，对照组LDH含量较少，模型组细胞中LDH含量是对照组的7～8倍（P＜0.05）。实验结果证实，PNS能提高H2O2诱导下的HT22细胞存活率，对HT22细胞具有保护作用。见图4。

图1　不同浓度H2O2对HT22细胞增殖活性的影响

图2　PNS对HT22细胞的保护效应

图3　PNS对H2O2损伤后HT22细胞活性的影响

图4　PNS对H2O2损伤后HT22细胞LDH含量的影响

2.5　细胞形态学观察

通过倒置荧光显微镜观察HT22细胞形态变化，发现对照组细胞形态完整，多呈多边形，折光性好。经500μmol/L H2O2作用24 h后，细胞形态发生明显改变，细胞密度降低，细胞核皱缩。10.00 mg/L PNS预处理2 h后，加入500μmol/L H2O2作用24 h后发现，与对照组相比细胞密度减少，但细胞形态有伸展的梭形。见图5。

2.6　细胞凋亡变化

流式细胞术检测发现，对照组HT22细胞几乎没有凋亡，而500μmol/L H2O2作用24 h后细胞凋亡率升高，早晚期占（36.313±3.623）%，坏死率为（4.043±1.261）%，10.00 mg/L PNS预处理2 h后，加入500μmol/L H2O2作用24 h，细胞凋亡率递减，早晚期占（15.732±2.284）%，坏死率为（2.042±0.546）%，表明PNS对HT22细胞具有保护作用，能减轻H2O2对HT22细胞的损伤程度。见图6。

图5　PNS对H2O2损伤后HT22细胞形态变化的影响

图6　HT22细胞凋亡情况

3　讨论

TBI包括创伤部位的直接损伤和创伤后缺血缺氧、钙通道异常，以及过氧化病理过程所介导的继发性损伤[10]。TBI治疗手段包括手术、亚低温和药物治疗等。目前，中草药辅助治疗脑损伤已成为国内外研究的热点[11]，但仍需要研究者不断研究与探讨，使脑损伤患者能获得更佳的治疗效果。

PNS具有多方面的药理功效，不仅具有抗血小板凝聚、溶栓及提高纤溶酶原激活作用，还能促进造血功能、抑制心肌收缩、扩张脑血管、耐缺氧和抗休克[12-13]。如今，三七在镇痛、抗炎、抗肿瘤、抗衰老、提高免疫调节功能方面研究得越来越多[14-15]。本研究以H2O2对HT22细胞造成损伤，成功建立缺血性损伤离体模型，以PNS作用H2O2损伤后的HT22细胞，结果证实H2O2对HT22细胞的损伤，以及PNS对HT22细胞的保护。PNS降低H2O2对HT22细胞的损伤，以此保护神经元细胞。

常用的细胞氧化损伤模型有2种：H2O2损伤模型和过氧化脂损伤模型，其中H2O2的应用最为广泛[16]。同时H2O2和细胞的氧化应激（oxidative stress，OS）密切相关[17]。OS是机体遭受外界刺激后，体内的氧化和抗氧化作用失衡，导致体内高活性分子产生逐渐增多，引起组织细胞损伤，自由基在体内产生负面作用，被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素[18]。脑外伤后，损伤部位的脑组织会产生大量的自由基，引起神经元水肿和坏死，造成神经元氧化应激损伤，是导致继发性脑损伤的重要原因。

参 考 文 献：

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