刘国涛，郭栋，刘全达，程宇，周丁华

（1.锦州医科大学火箭军总医院研究生培养基地，辽宁 锦州 121001；2.中国人民解放军火箭军总医院，北京 100088）

Ⅰ型糖尿病是由于胰岛β细胞缺失引起的自身免疫性疾病。精密的血糖监测和频繁的外源性胰岛素给药延迟了微血管疾病的进展，包括视网膜病变和神经病变，但并不能完全阻止这些并发症[1]。如何治疗和预防Ⅰ型糖尿病及并发症的发展，已成为迫切需要解决的任务。胰岛移植是治愈Ⅰ型糖尿病最有希望的方法[2]。但是，国内外对胰岛移植的部位还没有统一认识，选择较多的移植部位是门静脉、肾包膜等。因此，本实验通过比较胃浆膜下层和门静脉胰岛移植来观察糖尿病大鼠的治疗效果，寻找更为理想的移植部位，为临床应用提供实验和理论基础。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1实验动物8～10周龄SD雌性大鼠40只（军事医学科学院实验动物中心）。

1.1.2 实验试剂链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）、胶原酶Ⅺ、Hanks液、Ficoll400、RPMI 1640、台盼蓝购自美国Sigma公司，双硫腙（Dithizone，DTZ）（北京国药集团化学试剂有限公司）。

1.2　方法

1.2.1STZ诱导糖尿病大鼠模型取8周龄SD雌性大鼠18只，禁食24 h（不禁水）。在黑暗环境中，将STZ粉末溶于柠檬酸缓冲液中（pH 4.2～4.6）。采用55 mg/kg STZ腹腔一次给药，将受体大鼠诱导为1型糖尿病。注射后72 h检测非空腹血糖，连续5 d在固定时间（上午8：00～10：00）检测大鼠非空腹血糖＞16.7 mmol/L，并出现多尿、多饮、多食、体重下降等糖尿病症状，表明糖尿病大鼠模型复制成功。按照随机数字表法，将糖尿病大鼠分为胃浆膜组、门静脉组、对照组，每组6只。

1.2.2胰岛分离与纯化10%水合氯醛通过腹腔注射麻醉大鼠，取仰卧位固定。切开腹部，暴露胆总管。用动脉夹夹住胆总管上部，以及胆总管与十二指肠交汇处。穿刺胆总管，灌注1 mg/ml胶原酶Ⅺ溶液3～4 ml。胰腺充盈良好后（见图1），将胰腺组织完整切除，去除胰腺周围的脂肪和淋巴组织。将胰腺组织剪碎至约1 mm大小后移入离心管中，置于38℃水浴缸中消化20 min，轻微振荡1 min，见胰腺组织呈泥沙状，加入冷RPMI 1640液体20 ml终止消化。60目不锈钢丝网过滤后，将细胞悬液于4℃、1 000 r/min离心5 min（标准加速度=9，减速度=9），弃上清，洗涤3次后均分到15 ml离心管中，4℃、1 500 r/min离心2 min。向离心管中加入25% Ficoll 4 ml与沉淀物混匀，依次添加23%、20%和11% Ficoll各2 ml，4℃、2 000 r/min离心15 min（标准加速度=5，减速度=2）。离心后将20%～23%和23%～25%界面的胰岛吸出，RPMI 1640液洗涤2次，将分离出的胰岛移入RPMI 1640培养基，备用。

图1　 胰腺胶原酶Ⅺ灌注

1.2.3胰岛当量（islet equivalent，IEQ）和纯度测定对胰岛进行特异性染色，显微镜下DTZ阳性细胞染成猩红色，其他胰腺组织不着色。胰岛细胞直径＞150μm为1 IEQ[3]。胰岛纯度（%）=（DTZ阳性细胞数/细胞总数）×100%[4]。

1.2.4胰岛活性测定0.4%台盼蓝染色判断胰岛细胞活性，正常活胰岛不着色；死细胞或细胞膜不完整的胰岛可被台盼蓝染成蓝色。胰岛细胞成活率（%）=（1-死细胞数）/细胞总数×100%[4]。

1.2.5胰岛移植10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉糖尿病大鼠，取仰卧位固定。上腹部正中切口，暴露大鼠胃远端，用无损伤组织镊固定胃远端，待胃节律性收缩后，将装有1 ml胰岛的注射器针头，穿刺进入胃浆膜下层，将备用的500 IEQ注入胃浆膜下层。穿刺完毕后，拔出针头，用干净无菌棉签按压穿刺部位2 min，直到穿刺部位无液体渗出后，逐层关闭腹腔。术后肌内注射20万u青霉素钠，预防感染。同时按上述方法将同等数量的胰岛注入门静脉。对照组则将相同体积的RPMI 1640注射到胃浆膜下层和门静脉。

1.2.6血糖监测STZ模型复制成功后连续5 d非空腹监测糖尿病大鼠血糖浓度，求其平均值。移植后1周内每天在固定时间（上午8：00～9：00）监测血糖。以后监测血糖3次/周。非空腹血糖持续≤11.1 mmol/L为移植胰岛功能正常的标准，非空腹血糖连续2 d＞11.1 mmol/L为移植胰岛功能丧失的标准[5]。

1.2.7腹腔葡萄糖耐量实验移植后10 d，禁食12～18 h后测量大鼠血糖浓度。每只动物腹腔内注射葡萄糖2 g/kg，并在第0、5、10、15、30、60、90和120 min测量血糖浓度。

1.3　统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量数据以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验或方差分析，方差分析的两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　胰岛分离、纯化及活性判断

分离、纯化后的胰岛呈圆形或椭圆形细胞团（见图2A）；DTZ染色后显微镜下观察胰岛呈猩红色，内含大量粗糙颗粒（见图2B）；选取直径≥150μm胰岛，每只大鼠可以获取（310±42）IEQ，纯度达（89.00±4.52）%。胰岛经台盼蓝染色后，可见胰岛周边被染成蓝色（见图2C），胰岛存活率为（89.08±3.76）%。

2.2　胰岛移植前后血糖变化

胰岛移植后胃浆膜组和门静脉组大鼠血糖在48 h内降至正常，经t检验，差异有统计学意义（t=6.081和11.837，P=0.002和0.000）。移植前后，3组大鼠平均血糖浓度比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较经LSD-t检验，门静脉组胰岛移植后的平均血糖浓度低于对照组（P＜0.05）；胃浆膜组胰岛移植后的平均血糖浓度低于门静脉组（P＜0.05）。胃浆膜组和门静脉组大鼠胰岛移植前后血糖浓度比较，经t检验，差异有统计学意义（t=6.406和7.086，均P=0.000），两组移植后血糖浓度低于移植前。见表1。

对照组、胃浆膜组、门静脉组在胰岛移植后1、3、5、7、11、14、18、21、25 和 28 d 的非空腹血糖浓度比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的血糖浓度有差异（F=162.803，P=0.000）；②3组大鼠血糖浓度有差异（F=2546.796，P=0.000），胃浆膜组和门静脉组的血糖浓度较对照组低，胃浆膜组和门静脉组胰岛移植后大鼠血糖控制较好；③3组大鼠血糖浓度变化趋势有差异（F=1591.211，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，胃浆膜组和门静脉组大鼠18 d时血糖浓度与21、25和28 d比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；21和25 d血糖浓度与28 d比较，差异有统计学意义（P=0.000）。见表2和图3。

图2　胰岛分离、纯化及活性判断　（×10）

2.3　胰岛移植后有效控制血糖时间比较

胰岛移植后胃浆膜组与门静脉组有效控制血糖时间分别为（18.0±1.9）和（11.6±2.5）d，经t检验，差异有统计学意义（t=4.571，P=0.002），胃浆膜组比门静脉组控制血糖时间更长。见图4。

2.4　糖耐受功能比较

胰岛移植后10 d，对照组、胃浆膜组、门静脉组大鼠在空腹状态下行腹腔葡萄糖耐量实验。分别于腹腔注射2 g/kg葡萄糖后0、5、10、15、30、60、90和120 min监测血糖变化，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点血糖浓度有差异（F=285.789，P=0.000）；②3组大鼠血糖浓度有差异（F=2131.676，P=0.000），门静脉组和胃浆膜组的血糖浓度较对照组低，门静脉组和胃浆膜组糖耐受功能较好；③3组大鼠血糖浓度变化趋势有差异（F=835.737，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，30 min时，3组大鼠血糖浓度比较差异有统计学意义（P＜0.05），胃浆膜组糖耐受功能较对照组好，门静脉组糖耐受功能较胃浆膜组好。见表3和图5。

表1　3组大鼠移植前后血糖浓度比较（n =6，mmol/L，±s）

表1　3组大鼠移植前后血糖浓度比较（n =6，mmol/L，±s）

注：1）与移植前比较，P ＜0.05；2）与对照组比较，P =0.05；3）与胃浆膜组比较，P ＜0.05

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表2　3组大鼠移植后不同时间点的血糖浓度比较　（n =6，mmol/L，±s）

表2　3组大鼠移植后不同时间点的血糖浓度比较　（n =6，mmol/L，±s）

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图3　3组大鼠胰岛移植后的血糖变化趋势

图4　胃浆膜组与门静脉组大鼠胰岛移植后有效控制血糖时间比较　（n =6，±s）

表3　3组大鼠葡萄糖耐量实验不同时间点的血糖浓度比较　（n =6，mmol/L，±s）

表3　3组大鼠葡萄糖耐量实验不同时间点的血糖浓度比较　（n =6，mmol/L，±s）

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图5　3组大鼠胰岛移植后腹腔葡萄糖耐量实验的血糖变化趋势

3　讨论

胰岛移植是目前治愈Ⅰ型糖尿病的重要方法之一。胰岛移植的成功受多种因素的影响，不仅与胰岛高活性及高纯度有关，合适移植部位也成为其能否移植成功的重要因素之一。刘定志等[4]认为，理想的移植部位要求移植手术操作方便、成功率高、并发症少、存活率高、易于活检等[4]。目前，胰岛移植的部位主要包括门静脉、肾包膜、脾、腹膜、大网膜、肌肉等[6]。通过门静脉移植到肝脏已成为目前最常用的移植部位，但研究发现其并不是最理想的移植部位[7]。门静脉内氧分压低、血糖浓度及免疫排斥药物浓度高、移植胰岛接触血液后易引发急性血液介导的炎症反应及移植后的胰岛栓塞，阻滞门静脉血流，发生缺氧和周围肝组织破坏，这些都是影响胰岛存活的重要因素，是移植前期胰岛丧失的主要原因[8-9]。胃肠道被认为是胰岛移植的良好部位，不仅可以提供密集的血管网络、血液经门静脉回流入肝，而且与胰腺具有相同的胚胎源性，便于移植[10-12]。胃浆膜下层也可以有效地避免门静脉胰岛移植风险。本实验发现，胰岛移植后胃浆膜组和门静脉组大鼠血糖浓度较移植前下降，均在48 h内降至正常，且低于对照组。胃浆膜组和门静脉组在移植后21和14 d血糖浓度开始升高，表明胰岛功能开始减退；门静脉组胰岛移植后14 d血糖开始升高，表明胃浆膜下层胰岛移植血糖的有效控制时间比门静脉移植时间更长，胃浆膜下层胰岛移植的效果要优于门静脉移植。腹腔葡萄糖耐量实验表明，胰岛移植后胃浆膜组和门静脉组大鼠早期的糖耐受功能良好，与对照组差异明显。

总之，本实验结果表明，胃浆膜下层胰岛移植比门静脉操作更简单，安全性更高。且本实验发现，胃浆膜下层胰岛移植的短期治疗效果更好。胃浆膜下层有望成为胰岛移植的最理想的部位之一。本实验也为胃浆膜下层胰岛移植在临床的应用提供了实验基础。但本实验只涉及2个部位且样本量较少，还需进一步研究证实。

参 考 文 献：

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