朱子云

重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是一种以骨骼肌疲劳、波动性无力以及晨轻暮重现象为临床特征的自身免疫性神经肌肉接头传递障碍疾病［1］。本病临床严重患者通常因为累及呼吸相关肌肉群进而危及生命。据报道，MG的年发病率约为5.3/100万，且呈现逐年增长势头［2］。但至今其具体详细的发病机制尚不清楚，自身抗体如乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，AchR）抗体破坏 AchR 诱发神经递质传递障碍是目前研究认可的MG发病原因，而自身抗体的过度分泌与免疫系统平衡紊乱密切相关［3］。 辅助性 T 细胞（T helper，Th）对 B 细胞分化分泌抗体的过程尤为关键。辅助性T细胞主要分为 Th1、Th2、Th9、Th17 和 Treg 细胞，其中 Th1、Th2、Th17和Treg等T细胞亚群与MG的发病关系已经得以揭示，而辅助性T细胞亚群Th9是新近发现的一类CD4+Th细胞亚类，主要分泌IL-9效应细胞因子，已有大量研究证实其在多种炎性疾病中发挥重要作用，但其是否也在MG患者中存在异常，目前尚不清楚［4］。据此，该研究拟通过检测MG患者外周血Th9细胞频率及血清IL-9浓度，探讨其在MG发病中的作用。

1　资料与方法

1.1对象及分组 选取2014年1月—2017年6月于九江市第一人民医院神经内科就诊且被明确诊断的MG患者31例为MG组，其中男17例，女14例；年龄平均（43.51±16.92）岁。 诊断确诊标准［5］：在具有MG典型临床特征的基础上，具备药理学特征和（或）神经电生理学特征，临床上则可诊断为MG。有条件的单位可检测患者血清AChR抗体等，有助于进一步明确诊断。排除标准：排除发病前3个月内使用激素或免疫抑制药患者，排除伴有肿瘤、感染及其他自身免疫性疾病患者。同时选取同期该院体检中心30例健康体检者作为对照组，其中男15例，女 15 例；年龄平均（42.79±16.53）岁。MG 组和对照组在年龄、性别构成比等一般资料间均无统计学差异，具有可比性（P＞0.05）。

1.2血液标本采集 采集MG和健康对照者清晨空腹静脉学6 ml，其中3 ml收集至干燥管用于血清IL-9浓度、anti-AchR浓度的检测；另3 ml放置于EDTA抗凝管中，2 h内完成外周血Th9细胞频率的流式细胞术检测。

1.3流式细胞术检测Th9细胞频率 采用贝克曼FC-500流式细胞仪检测外周血Th9细胞频率。其中所需要的抗人CD3、CD4和抗人IL-9抗体均购自ebioscience公司。检测步骤如下：（1）RPMI 1640调整PBMC浓度至2.0×106/ml，接种于6孔板中加入25 ng/ml佛波酯、500 ng/ml离子霉素及1.7 μg/ml莫能霉素，37℃5%CO2培养箱中培养 4 h；（2）加入抗 CD3和CD4抗体各10 μl，充分混匀，避光孵育15 min；（3）磷酸盐缓冲液对混合细胞洗涤2次后离心去上清；（4）固定剂固定15 min，磷酸盐缓冲液洗1次后离心去上清；（5）加入破膜剂室温孵育5 min后离心去上清；（6）加入抗 IL-9 抗体 10 μl，避光孵育15 min；（7） 离心去上清后加入500 μl PBS悬浮后上机检测。目的细胞Th9免疫表型为CD3+CD4+IL-9+。所得数据采用仪器自带软件获取。

1.4血清IL-9、Anti-AchR水平测定 酶联免疫法用于血清IL-9水平的测定，所需试剂盒购自ebioscience公司 （IL-9 Human ELISA Kit， 批号：BMS2081TEN），所有操作步骤按照说明书步骤和条件展开。此外，血清Anti-AchR浓度采用人anti-AChR放免试剂盒检测，购自英国RSR公司（Human Anti-AChR ELISA Kit，批号：HZ-EL-H0347c）。

1.5统计学处理 利用SPSS 19.0统计分析软件处理数据，所有数据以均数±标准差形式表示，其中组间差异比较采用两样本t检验；组间相关性分析利用Spearman分析，以p＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组外周血Th9细胞频率、血清IL-9及anti-AchR浓度比较 流式细胞术测定结果表明MG患者外周血Th9细胞频率显著高于健康人群所组成的对照组，组间差异有统计学意义（p＜0.05）。此外，血清IL-9水平和anti-AchR的浓度均显著高于对照组，差异均有统计学意义（p＜0.05）。见表1。

表1　Th9细胞比例和血清IL-9浓度变化

2.2MG患者Th9细胞频率、IL-9浓度及anti-AchR浓度间相关性分析 利用Spearman分析各指标间相关性发现，MG患者外周血Th9细胞比例与血清IL-9浓度呈显著正相关性 （r=3.921，p＜0.05），与血清anti-AchR浓度间亦存在显著正相关关系 （r=2.199，p＜0.05）。 同时， 血清 IL-9浓度与anti-AchR浓度之间的相关性也具有统计学意义（r=2.286，p＜0.05）。

3　讨论

时至今日MG的发病机制仍不清楚，过度的自身抗体分泌使得其被归为自身免疫性疾病，近年来随着免疫学研究的不断深入，MG病因学过程被证实涉及多种免疫细胞和细胞因子，免疫系统平衡的破坏被认为是MG发病的关键环节［6］。然而，详尽的机制并未得以阐明。Th细胞可辅助B细胞分化成可分泌抗体的B细胞，且自身可分泌一系列炎症因子和抑炎因子，同时参与自身免疫性疾病的发病过程［7］。 目前研究已经明确Th细胞可分为 Th1、Th2、Th9、Th17以及Treg细胞等亚类，且其在胸腺发育和成熟。而临床研究证实约80%的MG患者通常合并胸腺异常，诸如胸腺增生和胸腺瘤。胸腺微环境的变化可能参与了MG的发生［8］。据此推测在胸腺分化发育的Th细胞或与常伴随胸腺异常的MG存在一定的关联。既往研究已经证实Th1、Th2、Th17以及Treg细胞在MG患者及小鼠模型中存在异常，而新型辅助性细胞亚群Th9在MG中的作用尚不明了。IL-9可维持并促进CD4+T细胞、肥大细胞和Th17及Treg细胞的存活，这是其发挥生物学作用最重要的功能。Th9通过发挥自分泌和旁分泌作用，促进T细胞增殖并增强其他类Th细胞亚群的活化和细胞因子的产生。Th9和IL-9可作用于多种细胞，故参与疾病的机制亦有所不同。

该研究通过流式细胞术检测MG患者外周血Th9细胞频率的变化及血清IL-9浓度，并与健康对照人群进行比较，发现Th9细胞频率和血清IL-9浓度在MG患者中均显著高于对照组，差异显著。这与崔冉等［9］在类风湿性关节炎患者外周血中发现的结果类似，其中Th9表达的百分率与RA患者的DAS28、红细胞沉降率、关节压痛数、关节肿胀数正相关。此外，Ouyang等［10］在系统性红斑狼疮患者中亦发现Th9和IL-9存在显著高表达。以上结果提示Th9参与多种自身免疫性疾病的发病过程，其中包括MG。此外，Spearman分析发现MG患者外周血Th9细胞比例与血清IL-9浓度呈显著正相关，血清IL-9则与anti-AchR浓度间也存在显著正相关。这与先前Yao等［11］在GM实验大鼠模型中已经注射IL-9可减缓GM相关临床症状，且血清anti-AchR浓度下降等研究结果相符。此外，在桥本甲状腺炎患者中发现的结果也与该研究类似，即外周血Th9细胞比例、血清IL-9浓度均比健康人群显著上调，且与相关抗体滴度相关［12］。

总之，该研究发现MG患者外周血存在Th9细胞和血清IL-9水平的异常变化，推测其可能参与了MG的发病过程，具体分子机制有待进一步研究。

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［2］中华医学会神经病学分会神经免疫学组.中国重症肌无力诊断和治疗指南 2015［J］. 中华神经科杂志，2015，48（11）：934-940.

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［5］中华医学会神经病学分会神经免疫学组.中国重症肌无力诊断和治疗指南 2015［J］. 中华神经科杂志，2015，48（11）：934-940.

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［7］李娜，张家祥，朱启星.Th细胞亚群失衡在免疫性肝损伤中的研究进展［J］. 安徽医科大学学报，2016，51（9）：1384-1387.

［8］刘岚剑，杨文娟.重症肌无力合并胸腺病变患者血清乙酰胆碱受体抗体、肌联蛋白抗体和肌肉特异性酪氨酸激酶抗体的检测意义［J］. 临床荟萃，2016，31（7）：758-761.

［9］崔冉，徐建华.类风湿关节炎患者外周血Tfh及Th9的变化及临床意义［J］. 中华微生物学和免疫学杂志，2012，32（2）：114-118.

［10］ OU Y，SHI Y，LIU Z，et al.Increased interleukin 9 and CD4+IL-9+T cells in patients with systemic，lupus erythematosus［J］.Molecular Medicine Reports，2013，7（3）：1031.

［11］ YAO X，KONG Q，XIE X，et al.Neutralization of interleukin-9 ameliorates symptoms of experimental autoimmune myasthenia gravis in rats by decreasing effector T cells and altering humoral responses［J］.Immunology，2014，143（3）：396.

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