肖遵强　黄静　于茜　张孔亮　熊超杰　陆才德

原发性肝癌是国人最常见的恶性肿瘤之一[1]。目前临床治疗肝癌最有效的方法是手术切除，但我国大部分肝癌患者有乙型肝炎肝硬化背景，肝硬化后肝脏可切除体积减少，术后往往出现肝脏剩余体积不足，导致肝衰竭。2012年德国学者首次报道了一种新的手术方式-联合门静脉结扎与原位肝脏劈离的二步肝切除术（associating liver partition with portal vein ligation for staged hepatectomy,ALPPS）[2]。ALPPS可在短期内大大增加术后肝脏剩余体积，提高手术切除率，但该术式主要应用于转移性肝癌[3]，应用于原发性肝癌的报道少见。目前已有正常大鼠ALPPS模型建立的报道[4-5]。本研究在肝硬化大鼠上成功建立ALPPS模型，现报道如下，以供同行参考。

1　材料和方法

1.1材料113只健康雄性SD大鼠购于浙江省医学科学院，饲养于宁波大学无特定病原体（SPF）级动物房，周龄6～8周，体重（200±20）g。四氯化碳（CCl4）、1%戊巴比妥钠购于宁波航景生物有限公司，青霉素购于山东圣旺药业有限公司，苏木素-伊红购于北京索莱宝科技有限公司。手术显微镜购于美国Olympus公司，显微外科手术器械为北京北方三友医疗器械有限公司产品，托盘天平购于宁波市义久电子科技有限公司，单微级电凝购于广州市邦善医疗器械有限公司，2-0丝线、5-0丝线、8-0丝线为美国强生公司产品，自制鼠台。

1.2方法

1.2.1大鼠肝硬化模型建立采用腹腔注射CCl4的方法建立大鼠肝硬化模型[6]，60%CCl4的橄榄油溶液3ml/g腹腔皮下注射，3次/周。50只大鼠按腹腔注射CCl4的时间分为正常组和实验组，实验组又分为4周组、8周组、12周组、16周组，每组10只。4个实验组分别于第4、8、12、16周末处死大鼠，正常组于16周末处死大鼠。

1.2.2肝硬化大鼠ALPPS模型建立[图1、图2（见插页）]选取成模率最高的实验组，按照该组方法再建肝硬化大鼠模型50只。该50只肝硬化大鼠行ALPPS。所有操作均在清洁的环境下实施。所有大鼠术前禁食12 h、禁水4 h。手术方法：1%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉，腹部剃毛后，固定于鼠板，消毒铺巾，放置于显微镜下，作正中切口，逐层开腹；开腹后首先游离大鼠镰状韧带，沿肝叶游离肝周韧带，充分松解肝脏，用湿润棉签将肝叶翻出腹腔，暴露肝门结构，注意切勿暴力翻转，避免肝脏划伤；自门静脉下端向上端分离门静脉，避免损伤胆管；沿各肝叶外解剖门静脉分支，并使与之伴行的肝动脉与肝胆管之间有较充分的空隙。大鼠肝脏按顺时钟方向分为尾叶、右叶、中叶、左内叶、左外叶、乳头叶，各叶具有相对独立的Glisson系统和脉管回流系统，用5-0丝线分别结扎大鼠尾叶、右叶、左外叶、左内叶处门静脉分支，保留中叶及乳头叶血供。当出现右叶与左内叶缺血线后作标记，采用8-0丝线结扎左右肝实质后用显微剪沿缺血线标记进行肝实质劈离。肝断面出血点用8-0丝线结扎或用微单级电凝止血。最后，用无菌塑料薄膜包裹肝断面，防止术后断面粘连，术后用5%葡萄糖氯化钠溶液5ml腹腔内滴注，予2-0丝线关腹；术毕，青霉素20万U/kg大腿内侧肌肉注射，38℃电热毯复温至大鼠苏醒。术后7d处死大鼠，观察肝脏结构。

图1　SD大鼠各门静脉分支、肝叶比重及ALPPS示意图

1.3观察指标各组肝硬化大鼠处死后，肝脏组织固定保存于甲醛溶液中，组织切片后行HE染色，在Olympus显微镜下观察肝脏组织形态学变化，以出现假小叶视为建模成功，比较各组大鼠成模率。肝硬化大鼠ALPPS模型以大鼠术后存活7d及以上视为建模成功，观察肝硬化大鼠ALPPS建模成功率。

2　结果

2.1肝硬化大鼠建模结果

2.1.1一般情况4周组、8周组、正常组大鼠至处死时间前全部存活（死亡率0.0%），12周组大鼠至处死时间前死亡2只（死亡率20.0%，），16周组大鼠至处死时间前死亡7只（死亡率70.0%）。解剖死亡大鼠，腹腔未见明显损伤，考虑长时间腹腔注射CCl4，个体剂量不耐受，中枢抑制、呼吸衰竭致死亡。12周组成模率最高，为80.0%，各组大鼠成模率比较见表1。

表1　各组大鼠成模率比较

2.1.2大鼠肝脏改变见图3（插页）。

由图3可见，正常组大鼠肝脏被膜光滑，呈暗红色，质地中等，边缘锐利。实验组大鼠随着腹腔注射CCl4时间的延长，肝脏被膜见部分纤维化，色泽较正常肝脏暗淡，质地偏硬，边缘圆钝，肝脏被膜与邻近器官有轻度粘连；肝脏病理改变为肝细胞脂肪变性和炎症同时存在，肝组织出现不同程度的水样变性及气球样变性，变性程度轻者肝细胞肿大，胞质疏松、淡染，有些肝细胞内可见小空泡形成，变性程度较重者细胞体积明显增大变圆；随着腹腔CCl4注射时间的延长，8周组炎症及脂肪变性最明显，12周组可见肝纤维化明显增加。

2.2肝硬化大鼠ALPPS建模结果本研究选择12周组肝硬化大鼠为行ALPPS的大鼠。50只肝硬化大鼠，术后存活7d及以上40只，建模成功率为80.0%，手术时间（26.75±12.15）min；死亡原因主要为术前麻醉过深，术中失血、膈肌穿孔、下腔静脉损伤、肝静脉分支损伤，术后肝功能衰竭、胆瘘、腹腔感染。存活大鼠7d后处死可见肝右中叶明显增大。

3　讨论

CCl4是建立肝硬化大鼠模型的常见诱导剂，其主要的诱导机制是是氧化应激反应，通过细胞色素p450介导活化引起的实验性肝损伤的自由基[7]，影响肝细胞的细胞膜结构和功能，纤维结缔组织明显增生，最终形成肝硬化。腹腔注射具有操作简便、动物吸收快、肝药物浓度高、成模时间短、毒副作用降低等优点，死亡率为20%～35%[8]。崔承虎等[9]报道腹腔注射给药肝硬化建模效果优于皮下注射和灌胃方法，大鼠死亡率腹腔注射、皮下注射、灌胃依次升高。本研究需二次建模，需选择肝硬化成模率高且建模时间短的方法，保证行ALPPS手术时，大鼠尽可能处于壮年期，减少鼠龄对ALPPS效果的影响。

SD实验大鼠是一种应用广泛的实验动物，在解剖和组织结构、生理现象、生化代谢、疾病的发生机理特点等方面与人类很相似。大鼠肝脏按顺时钟方向分为尾叶、右叶、中叶、左内叶、左外叶、乳头叶，各叶具有相对独立的Glisson系统和脉管回流系统，各肝叶形态、比例较为恒定，易行门静脉分支的分离和结扎，而对其他肝叶无影响[10]。另外，大鼠肝中叶与左内叶解剖上虽然相连，但血供独立，为肝实质离断模型建立创造条件。有学者采用保留中叶的血供，劈离肝中叶与左内侧叶术式的ALPPS模型，其保留的残肝约为28%[10]。笔者曾用16周组大鼠与12周组大鼠行预实验，结果显示16周组与12周肝硬化大鼠行ALPPS后，7d内大鼠均死亡，考虑肝硬化后，术后肝剩余体积不足，出现肝衰竭死亡。为此，笔者参考SD大鼠肝叶的解剖[11]，增加了不结扎肝叶的数量，保留中叶及乳头叶的血供，其保留的残肝约为35%。但笔者发现16周组大鼠依然无法耐受手术，而12周组肝硬化大鼠尚能耐受手术，其原因可能是16周组大鼠肝硬化更为严重。另外，分析肝硬化大鼠成模率，16周组大鼠肝硬化成模率远低于12周组，故本实验采用12周组肝硬化大鼠作为ALPPS建模大鼠。

笔者总结ALPPS操作要点如下。（1）手术入路：开腹时应选择正中切口，防止腹壁静脉损伤，减少出血，且切口不易过大，以4～5cm为宜，避免肠管外露影响操作，同时避免术后感染风险的增加。（2）手术暴露：因大鼠肝脏位于横膈下的上腹部，位置较高，常规难以暴露，可在大鼠背部垫高，使肝脏位置下移，易于暴露；肝镰状韧带是肝中叶和左内叶的分隔标志，切断此韧带时，应在明视下操作，防止损伤膈肌，造成大鼠气胸死亡。（3）术中结扎：肝十二指肠韧带起于第一肝门，止于十二指肠，前窄后阔，可在显微镜下，先从十二指肠段处分离3者，以丝线分别悬吊；肝背下腔静脉被肝中叶、左内叶及尾状叶少许肝组织包绕，结扎右叶及尾叶时，应尽量在肝外解剖Glisson系统，且探针方向尽量沿矢状位解剖，避免探针捅伤肝背下腔静脉，引起术中难以控制的大出血。左外叶、左内叶血管共干，目前倾向于将左内叶与肝中叶视为同一解剖单位[11-12]，在肝外辨别其血管共干，避免单支结扎。（4）肝叶劈离：上述血管结扎后，正常大鼠可于中叶及左内叶见一明显缺血线，但肝硬化大鼠肝脏色泽较深，有时并不明显。行肝中叶及左内叶劈离时，可沿镰状韧带右侧约1mm进行。因肝中叶静脉直接汇入腔静脉，与肝镰状韧带平面几乎垂直，要避免损伤肝中叶静脉，以免造成术中大出血及血管内气栓。

综上所述，在CCl4腹腔注射法建立肝硬化大鼠模型上行ALPPS是安全可行的，可增大术后肝脏剩余体积。

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