李冰震　王理富　吴文元　陈景锋

IL-32是一种促炎细胞因子，包含6种主要的亚型（IL-32α、IL-32β、IL-32γ、IL-32δ、IL-32ε、IL-32ζ），其中最主要的为IL-32α[1-2]。研究发现，不同亚型的IL-32在炎症性肠病、肿瘤、自身免疫病等中扮演不同的角色，在细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长、增强炎症反应以及促进血管生成等过程中发挥不同的生理作用[3-5]。胰腺上皮细胞的上皮间质转化（EMT）与胰腺肿瘤的侵袭转移密切相关，其中钙黏附蛋白E（E-cadherin）的表达下调以及某些间质细胞标志物[如波形蛋白（Vimentin）、E盒结合锌指蛋白1（Zeb1）]表达上调被认为是EMT过程的标志[6-7]；金属基质蛋白酶（MMPs）可降解细胞基膜和外基质，与金属基质蛋白酶抑制物（TIMPs）保持动态平衡，在胰腺癌的侵袭转移中同样起重要作用[8]。Janus激酶（Jak）及其下游通路蛋白细胞信号转导和转录激活因子3（STAT3）可调节功能基因的转录，调控细胞凋亡、侵袭和转移等；Jak/STAT3信号通路参与调控胰腺癌EMT过程[9-10]。基于此，本研究将不同浓度的IL-32α作用于人胰腺癌细胞Panc-1、AsPC-1，检测胰腺癌细胞的EMT、侵袭转移及Jak2/STAT3信号通路的改变，探讨其作用机制，现报道如下。

1　材料和方法

1.1材料人胰腺癌细胞株Panc-1、AsPC-1购自上海生命科学研究所；重组人IL-32α购自北京义翘神州生物技术有限公司；STAT3、p-STAT3、Jak2、p-Jak2、E-cadherin、Vimentin、Zeb1、MMP-2、MMP-9、GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology公司；Trizol细胞裂解液购自美国Invitrogen公司；cDNA逆转录试剂盒购自美国Thermo公司；SYBR green RT-PCR反应试剂盒购自美国Thermo公司；蛋白浓度试剂盒购自广州白云天公司；7500荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；荧光显微镜（DM4000M）购自德国徕卡公司；自动曝光机（Image QuantTM400）购自德国Rawak Software公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与分组将Panc-1细胞株培养于含10%FBS的DMEM培养基中；人胰腺癌细胞AsPC-1细胞株培养于含10%FBS的1640培养基中；两者均置于37℃、5%二氧化碳的细胞培养箱中常规培养传代。在Panc-1及AsPC-1细胞株中分别添加不同浓度的IL-32α后分为0μg/ml组（空白对照组）、10μg/ml组、25μg/ml组、50μg/ml组。

1.2.2RT-PCR检测Vimentin、CDH1、Zeb1、MMP-2及MMP-9的mRNA表达水平采用Trizol细胞裂解液提取上述4组Panc-1、AsPC-1细胞总RNA；分光光度计检测所提取RNA的纯度及浓度；cDNA逆转录试剂盒合成cDNA，SYBR green RT-PCR反应试剂盒与不同的引物（引物序列详见表1）在7500荧光定量PCR仪中进行目标片段扩增；反应程序为（95°C 10min）×1个循环（95°C 15s）×40个循环（62°C 60s）×40个循环。实验重复3次，取平均值。

表1　引物序列

1.2.3Western blot检测E-cadherin、Vimention、Zeb1、MMP-2、MMP-9蛋白及Jak2/STAT3信号通路蛋白p-Jak2、Jak2、p-STAT3、STAT3表达水平用含有PMSF和磷酸酶抑制剂的RAPI裂解液（裂解液：PMSF：磷酸酶抑制剂=1 000∶10∶100）充分裂解上述4组Panc-1和AsPC-1细胞，提取总蛋白；并检测浓度；根据不同的蛋白浓度配比不同量PBS，加入4μl 5×SDS上样缓冲液配制成浓度相同总量为20μl的上样液；变性（100°C 5min）后加在5%浓缩胶及不同浓度的分离胶（8%～12%）中电泳，先以55V恒压进行，至浓缩胶和分离胶交界线处（通常至Marker条带显现）转换电压为110V。恒流转膜，电流为350mA，时间根据每个目的蛋白的分子量不同而异。将转有蛋白的PVDF膜放入5ml 5%脱脂奶粉液中封闭1～2h，弃去封闭液，1×TBST洗膜（3次，5min/次）；将膜置于载玻片上，用一抗4°C下孵育过夜，1×TBST液洗膜（3次，5min/次），再置于二抗液（1∶5 000）中室温摇床低速孵育1～2h，弃去二抗液，1×TBST液洗膜（3次，5 min/次）。用image lab自动曝光机检测相应的蛋白质条带，分析条带灰度值。实验重复3次，取平均值。

1.2.4细胞免疫荧光技术检测Vimentin蛋白表达将无菌黏附盖玻片置于6孔板中，每张玻片上滴25ug/ml的多聚赖氨酸1ml，室温下过夜。取上述4组对数生长期细胞，并将细胞悬液种植在黏附盖玻片上，培养基培养6～8h，待细胞贴壁且生长至70%～80%后，弃去原培养液，分别加入含不同浓度IL-32α的无血清培养液培养24h。弃去培养液洗涤后每孔加4%多聚甲醛1ml，室温固定10min后弃去，PBS清洗。加入0.3%Triton-100 1ml，室温孵育10min后弃去，PBS清洗。加入适量5%山羊血清室温封闭30min后弃去，将盖玻片覆盖于一抗液上，置于一抗孵育湿盒内4℃过夜，次日将盖玻片重新置于6孔板中，PBS清洗；避光二抗孵育(37℃60min)，PBS清洗；每孔滴加5μg/ml DAPI 1滴并将黏附盖玻片盖上，细胞核染色（37℃3min），PBS清洗；每孔滴加1滴抗荧光淬灭封片。荧光显微镜观察细胞形态，并选定位置分别拍细胞核和细胞质染色照。

1.3观察指标观察不同浓度IL-32α对胰腺癌细胞EMT、侵袭转移、Jak2/STAT3信号通路蛋白的抑制结果。1.4统计学处理应用SPSS 19.0统计软件；计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1不同浓度IL-32α对胰腺癌细胞EMT的抑制结果见图1。

图1　不同浓度IL-32α对胰腺癌细胞EMT的抑制结果（a、b：Vimentin、CDH1、Zeb1 mRNA表达水平比较；c、d：E-cadherin、Vimentin、Zeb1蛋白表达水平比较，内参蛋白为GAPDH；e、f：Vimentin蛋白免疫荧光染色强度比较；与0μg/ml组比较，*P＜0.05；与10μg/ml组比较，#P＜0.05；与25μg/ml组比较，△P＜0.05）

由图1 a、b可见，胰腺癌Panc-1、AsPC-1细胞EMT相关分子标志物上皮样标志物E-cadherin的mRNA CDH1表达水平均呈IL-32α剂量依赖性上调（均P＜0.05)，而细胞间质样标志物Vimentin、Zeb1的mRNA表达水平均呈IL-32α剂量依赖性下调（均P＜0.05)。

由图1 c、d可见，胰腺癌Panc-1、AsPC-1细胞E-cadherin的蛋白表达水平均呈IL-32α剂量依赖性上调（均P＜0.05），而Valentin、Zeb1的蛋白表达水平均呈IL-32α剂量依赖性下调（均P＜0.05）。

由图1 e、f可见，胰腺癌Panc-1、AsPC-1细胞Vimentin蛋白表达于细胞质中，免疫荧光染色强度呈IL-32α剂量依赖性下调（均P＜0.05）。

2.2不同浓度IL-32α对胰腺癌细胞侵袭转移的抑制结果见图2。

图2　不同浓度IL-32α对胰腺癌细胞侵袭转移的抑制结果（a、b：MMP-2、MMP-9 mRNA表达水平比较；c、d：MMP-2、MMP-9蛋白表达水平比较，内参蛋白为GAPDH；与0μg/ml组比较，*P＜0.05；10μg/ml组比较，#P＜0.05；与25μg/ml组比较，△P＜0.05）

由图2a、b可见，胰腺癌Panc-1、AsPC-1细胞中MMP2 mRNA均呈IL-32α剂量依赖性下调（均P＜0.05），胰腺癌AsPC-1细胞中MMP9 mRNA呈IL-32α剂量依赖性下调（均P＜0.05）。

由图2c、d可见，胰腺癌Panc-1、AsPC-1细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达水平均呈IL-32α剂量依赖性下调（均P＜0.05）。

2.3不同浓度IL-32α对胰腺癌细胞Jak2/STAT3信号通路蛋白的抑制结果见图3。

图3　不同浓度IL-32α对胰腺癌细胞Jak2/STAT3信号通路蛋白的抑制结果（内参蛋白为GAPDH）

由图3可见，胰腺癌Panc-1、AsPC-1细胞中Jak2/STAT3信号通路蛋白p-Jak2、Jak2、p-STAT3的表达水平均呈IL-32α剂量依赖性下调（均P＜0.05），STAT3的表达水平不受IL-32α浓度的影响（P＞0.05）。

3　讨论

胰腺癌的高度侵袭性通常被认为是患者预后极差的重要原因之一。EMT是肿瘤发生、发展过程中重要的生物学过程；它迫使最初的肿瘤细胞获得侵袭转移能力从而转移至肿瘤边缘，或者通过血液、淋巴液等其他媒介转移至人体的其他部位形成新的肿瘤灶[11]。EMT与胰腺癌患者淋巴结的转移、门静脉的癌栓形成以及患者的长期生存率有显著的相关性[12]。逆转EMT正成为越来越重要的临床治疗胰腺癌的目标。本研究结果显示，IL-32α不但可以从基因层面上促进转录因子CDH1，抑制转录因子Vimentin和Zeb1；还可从蛋白层面上促进E-cadherin蛋白的表达，抑制Vimentin和Zeb1蛋白的分泌。MMPs是一系列家族性肽链内切酶，在EMT过程中具有降解细胞基底膜的蛋白水解活性。MMPs在胰腺癌中已被证明具有增加细胞侵袭性，促进血管生成以及诱发药物抗性等作用；有研究认为其在胰腺癌的侵袭转移过程中是另一种重要的监控分子[13-14]。本研究结果显示，胰腺癌Panc-1、AsPC-1细胞分泌高水平的MMP-2和MMP-9；且RT-PCR结果显示MMP-2、MMP-9的mR-NA可被IL-32α抑制，Western blot结果也显示IL-32α可抑制MMP-2、MMP-9蛋白的分泌。但是，值得注意的一个现象是IL-32α抑制MMPs蛋白程度要远大于抑制mRNA程度，这提示IL-32α抑制胰腺癌细胞MMPs蛋白的表达可能是通过抑制基因的转录后水平实现。综上，笔者认为IL-32α可通过影响蛋白水解酶的激活以及黏附能力来部分抑制胰腺癌细胞的侵袭转移能力。这些发现反映了IL-32α影响胰腺癌生物学属性的潜在可能，当然，这需要进一步的体内外实验论证。

关于IL-32对肿瘤细胞EMT及侵袭转移的影响，许多学者持有不同的观点。一些研究者认为异常分泌的IL-32β可通过调节VEGF-STAT3信号通路来刺激肿瘤细胞的迁移[3]。也有研究发现肺腺癌细胞中IL-32可通过激活NF-κB增强MMP-2、MMP-9的表达，这些观点与本研究的结论有所矛盾[4]。笔者认为不同类型的肿瘤表达不同类型和数量的IL-32受体，这可以部分解释不同亚型的IL-32对各种肿瘤细胞所造成的差异影响。这提示，不同浓度的IL-32α是影响肿瘤细胞相关的生物学性能的另一个因素。此外，Jak2/STAT3通路被认为在胰腺炎诱导的Kras-依赖的胰腺癌肿形成中占有重要的地位[15]。本研究结果显示Jak2/STAT3信号通路可以被IL-32α抑制；这间接表明IL-32α类似AG490（Jak2的特异性抑制剂）具有潜在抑制胰腺癌细胞侵袭转移的能力，甚至存在逆转慢性胰腺炎诱导胰腺癌的可能。重要的是，本研究中还发现胰腺癌Panc-1、AsPC-1细胞都可自发的分泌高水平p-STAT3；虽然这并不是公认的典型与EMT相联系的途径，有研究证实STAT3通过相关机制改变转录因子Zeb1来影响肿瘤细胞的EMT[16]。本研究同样发现胰腺癌Panc-1、AsPC-1细胞中Zeb1表达水平随着p-STAT3的增多而显著上升。因此，胰腺癌Panc-1、AsPC-1细胞中自发分泌的高水平p-STAT3被IL-32α显著抑制可以认为是其抑制胰腺癌EMT与侵袭转移的一种重要机制；高水平的p-STAT3可能在维持EMT特性和胰腺癌细胞的侵袭性中发挥着重要作用。当然，不排除其他可能存在的IL-32α抑制胰腺癌Panc-1、AsPC-1细胞EMT及侵袭转移的潜在机制。

综上所述，胰腺癌具有高度侵袭性和低生存率的特性，本研究结果表明，IL-32α在一定剂量范围内以剂量依赖性的方式抑制胰腺癌Panc-1、AsPC-1细胞EMT和侵袭转移。IL-32α对于胰腺癌的精准治疗有潜在的临床运用前景。相比传统化疗药物，IL-32α作为一种内源性细胞因子具有无免疫原性以及低细胞毒性等优势，患者可在一定程度上减轻传统化疗药物所引起的诸多不良反应；但这些生物学功能均需要进一步的体内外实验研究。IL-32α及Jak2/STAT3信号通路或可作为潜在的药理干预胰腺癌进展的分子靶点。

[1]Shoda H,Fujio K,Yamaguchi Y,et al．Interactions between IL-32 and tumor necrosis factor alpha contribute to the exacerbation of immune-inflammatory diseases[J]．Arthritis research&therapy,2006,8(6)：R166．

[2]Shioya M,Nishida A,Yagi Y,et al．Epithelial overexpression of interleukin-32alpha in inflammatory bowel disease[J]．Clinical and experimental immunology,2007,149(3)：480-486．

[3]Park JS,Choi SY,Lee JH,et al．Interleukin-32beta stimulates migration of MDA-MB-231 and MCF-7cells via the VEGF-STAT3 signaling pathway[J]．Cellular oncology,2013,36(6)：493-503．

[4]Zeng Q,Li S,Zhou Y,et al．Interleukin-32 contributes to invasion and metastasis of primary lung adenocarcinoma via NF-kappaB induced matrix metalloproteinases 2 and 9 expression[J]．Cytokine,2014,65(1)：24-32．

[5]Sorrentino C,Di Carlo E．Expression of IL-32 in human lung cancer is related to the histotype and metastatic phenotype[J]．American journal of respiratory and critical care medicine,2009,180(8)：769-779．

[6]Huang C,Yang G,Jiang T,et al．The effects and mechanisms of blockage of STAT3 signaling pathway on IL-6 inducing EMT in human pancreatic cancer cells in vitro[J]．Neoplasma,2011,58(5)：396-405．

[7]Shaul YD,Freinkman E,Comb WC,et al．Dihydropyrimidine accumulation is required for the epithelial-mesenchymal transition[J]．Cell,2014,158(5)：1094-109．

[8]Lukaszewicz M,Mroczko B,Szmitkowski M．[The role of metalloproteinasesandtheirinhibitorsinpancreaticcancer][J]．Postepy Higieny I Medycyny Doswiadczalnej,2008,62(1)：141．

[9]Yu H,Kortylewski M,Pardoll D．Crosstalk between cancer and immune cells：role of STAT3 in the tumour microenvironment[J]．Nature Reviews Immunology,2007,7(1)：41．

[10]Xiong H,Zhang ZG,Tian XQ,et al．Inhibition of JAK1,2/STAT3 Signaling Induces Apoptosis,Cell Cycle Arrest,and Reduces Tumor Cell Invasion in Colorectal Cancer Cells[J]．Neoplasia,2008,10(3)：287．

[11]Lim J,Thiery JP．Epithelial-mesenchymal transitions：insights from development[J]．Development,2012,139(19)：3471．

[12]Kohler I,Bronsert P,Timme S,et al．Detailed analysis of epithelial-mesenchymal transition and tumor budding identifies predictors of long-term survival in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]．Journal of Gastroenterology&Hepatology,2015,30(S1)：78-84．

[13]Gao L,Zheng M,Zhu Y,et al．Selection of Peptide Inhibitor to Matrix Metalloproteinase-2 Using Phage Display and Its Effects onPancreaticCancerCell lines PANC-1 and CFPAC-1[J]．International Journal of Biological Sciences,2012,8(5)：650．

[14]Haage A,Schneider IC．Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells[J]．Faseb Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology,2014,28(8)：3589-3599．

[15]Lesina M,Kurkowski MU,LUDES K,et al．Stat3/Socs3 activation by IL-6 transsignaling promotes progression of pancreatic intraepithelial neoplasia and development of pancreatic cancer[J]．Cancer cell,2011,19(4)：456-469．

[16]Guo L,Chen C,Shi M,et al．Stat3-coordinated Lin-28-let-7-HMGA2 and miR-200-ZEB1 circuits initiate and maintain oncostatin M-driven epithelial-mesenchymal transition[J]．Oncogene,2013,32(45)：5272-5282．