何轶然　张治芬　王芳　吴红艳　贾涔琳　魏双双　黄坚　卓广超

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS），是青春期和育龄期妇女常见的生殖内分泌疾病，以卵巢分泌的雄激素过多、排卵障碍、糖脂代谢紊乱、月经失调为主要特征，其临床表现具有高度异质性，在育龄期妇女中发病率高达5%～10%[1]。近年来大量研究显示，PCOS患者普遍处于一种慢性轻度炎症状态[2]，其通过炎症信号传导通路与胰岛素信号传导通路进行交叉对话，诱发胰岛素抵抗，是PCOS患者胰岛素抵抗的始动因素和核心环节[3]。且PCOS患者体内炎症因子水平与其循环中雄激素水平呈正相关[4]。沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的脱乙酰酶，SIRT1可通过对组蛋白和非组蛋白以及多种转录因子的去乙酰化作用，影响多条信号通路，从而参与细胞衰老凋亡、胰岛素分泌、糖脂类代谢、血管生成、炎症反应等过程[5-7]。SIRT1过表达的转基因小鼠表现出卵泡发育成熟受抑制以及性成熟推迟[8]；而SIRT1基因缺失的小鼠，无论雄雌，均无生育功能[9-10]，提示SIRT1在调控哺乳动物生殖系统功能方面有着重要作用。目前关于SIRT1与PCOS的关系尚存在争议，我们找到了SIRT1下游的重要调控因子——叉头蛋白盒转录因子3a（forkhead-box transcription factor 3a，Fox-O3a），该因子在细胞自噬调控中具有重要作用。本研究拟通过定位与定量检测其在大鼠卵巢中的表达，探讨SIRT1/FoxO3a信号通路在PCOS大鼠卵巢发育中的作用机制。

1　实验动物和方法

1.1实验动物和试剂选取21日龄清洁级雌性SD大鼠20只，由浙江省医学科学院动物实验中心提供，饲养于（22±2）℃条件下，自由饮水，标准饲料喂养。主要试剂：脱氢表雄酮（DHEA）试剂（中国国药集团化学试剂有限公司，XW00534303，规格：98%）、ELISA试剂盒（美国CUSABIO公司）、一抗SIRT1、FoxO3a（武汉三鹰生物技术有限公司）、HRP标记山羊抗兔鼠二抗（武汉塞维尔生物科技有限公司）、总RNA提取试剂盒（武汉塞维尔生物科技有限公司）、引物：SIRT1、FoxO3a（武汉塞维尔生物科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1动物分组和模型制备大鼠适应性喂养4d后（25日龄），将体质量相当（60±10）g的大鼠采用简单随机化分组法分为两组：PCOS模型组（DHEA组）及正常对照组（NC组），每组10只。DHEA组颈部皮下注射DHEA 6mg/（100g·d）（DHEA溶于0.2ml芝麻油），NC组颈部皮下注射芝麻油0.2ml/d。两组均持续给药20d。1.2.2标本采集20d后，给予大鼠10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血，2 000r/min离心20min取血清，-80℃冻存待用。摘取大鼠双侧卵巢组织，剔除周围的脂肪及结缔组织后，称重，一侧卵巢经液氮浸没后于-80℃冰箱保存备用，另一侧卵巢采用4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片厚度为5μm。观察光镜下（HE染色）形态学改变。

1.2.3观察指标

1.2.3.1动情周期监测药物干预后10d，连续阴道涂片10d以监测大鼠动情周期的变化，显微镜下大鼠动情周期判断标准：（1）动情前期：以大而圆、形状规则的有核上皮细胞为主；（2）动情期：以无核的角质化细胞为主；（3）动情后期：可见有核上皮细胞、角质化细胞及白细胞，且3者构成比例相当；（4）动情间期：以大量白细胞为主。根据大鼠阴道上皮细胞是否存在周期性变化来判定造模是否成功。

1.2.3.2相关激素及生化指标测定采用ELISA法测定各组大鼠血清黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、睾酮（T）、空腹血糖值（FPG）及胰岛素（FINS）水平。采用终点法测定血清HDL、LDL、TC和TG水平。根据HOMA-IR的计算公式（HOMA-IR=FPG×FINS/22.5）计算HOMA-IR指数值。

1.2.4免疫组化取各组大鼠卵巢组织标本，石蜡切片脱蜡至水后置于柠檬酸抗原修复缓冲液（PH6.0）的修复盒中修复抗原20min，滴加一抗（SIRT1、FoxO3a稀释浓度为1∶100），4℃孵育切片，过夜。然后滴加HRP标记山羊抗兔鼠二抗覆盖，室温孵育50min。DAB显色，常规脱水封片，显微镜镜检，观察并比较各组棕黄色颗粒的阳性细胞表达情况。每组内每张切片随机挑选至少3个200倍视野进行拍照。拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。应用Image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA）软件选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值（IOD）以及组织的像素面积（AREA）。并求出平均光密度值IOD/AREA（Mean Density）用以定量分析。

1.2.5逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）采用总RNA抽提试剂盒提取卵巢组织总RNA。取2μg RNA逆转录合成cDNA，再取逆转录产物2.5μl进行PCR扩增。SIRT1引物序列上游：5′-TGACCTCCTCATTGTTATTGGG-3′，下游：5′-GGCATACTCGCCACCTAAC-CT-3′；FoxO3a引物序列上游：5′-AACAGTACCGTGTTCGGACC-3′，下游：5′-AGTGTCTGGTTGCCGTAGTG-3′；内参GAPDH引物序列上游：5′-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3′，下游：5′-CATGAGGTCCACCACCCTGTT-3′。PCR反应：95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃复性1min，共40个循环。反应结束后，收集数据，采取2-ΔΔCT法进行相对定量分析。

1.3统计学处理采用SPSS 23.0统计软件，计量资料以表示，先采用正态性检验和方差齐性检验，若方差齐采用两独立样本t检验，方差不齐则采用t′检验；不符合正态分布的计量资料采用非参数检验。

2　结果

2.1大鼠动情周期观测结果NC组10只大鼠均保持规律的4d动情周期的阴道涂片变化，排卵率100%。DHEA组动情周期均出现紊乱，见大量角化上皮细胞，排卵率0%。

2.2大体解剖学及镜下改变NC组卵巢色泽红润，DHEA组卵巢表面偏白，体积增大，隐约见多个囊状扩张的卵泡。DHEA组HE染色后光镜下见多个囊性扩张的卵泡，卵泡体积异常增大，见闭锁卵泡，卵泡膜细胞细胞层局部凹凸不平，颗粒细胞层几乎消失不见，卵泡内充满大量的卵泡液；黄体中多见粒黄体细胞肿胀，胞质内大量圆形空泡，间质中少量淋巴细胞浸润。见图1（插页）。

2.3两组大鼠血清学指标比较见表1。

由表1可见，DHEA组血清T、TG、LDL水平高于NC组（均P＜0.05）。两组血清FSH、LH、TC、HDL、FPG、FINS、HOMA-IR水平差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表1　两组大鼠血清学指标比较

2.4两组大鼠卵巢组织免疫组化染色结果SIRT1、FoxO3a阳性染色细胞在两组卵巢组织中均可见，染色呈浅黄色至深棕色，见图2（插页）。平均光密度值定量分析结果可见DHEA组卵巢SIRT1表达明显增加（P＜0.01），FoxO3a表达水平呈升高趋势，但与NC组比较差异无统计学意义（P＞0.05），详见表2。

表2　两组大鼠卵巢组织SIRT1、FoxO3a蛋白平均光密度值比较

2.5两组大鼠卵巢组织RT-PCR结果DHEA组大鼠卵巢SIRT1 mRNA 38.75±34.31、FoxO3a mRNA 1.45±0.31，显著高于NC组（3.46±2.93、0.82±0.15），差异均有统计学意义（均P＜0.05），详见图3。

图3　两组大鼠卵巢组织SIRT1mRNA及FoxO3amRNA表达比较

3　讨论

3.1DHEA诱导PCOS大鼠模型的评价运用DHEA对SD大鼠进行PCOS造模是研究PCOS的经典造模方法[10]。本实验中，经DHEA皮下注射20d后，DHEA组大鼠动情周期全部失去规律性变化，提示大鼠无排卵。肉眼可见卵巢体积异常增大，隐约见多个囊状扩张的卵泡。镜下显示卵巢内多个囊性扩张的卵泡，卵泡体积异常增大，见闭锁卵泡，卵泡膜细胞细胞层局部凹凸不平，颗粒细胞层几乎消失不见，卵泡内充满大量的卵泡液；黄体中多见颗粒黄体细胞肿胀，胞质内大量圆形空泡，间质中少量淋巴细胞浸润。DHEA组大鼠血清T、TG、LDL水平明显增加。以上数据表明，本实验所复制的动物模型无论是从病理形态学变化，还是血清激素水平均与PCOS患者相似。说明PCOS大鼠模型制备成功。

3.2SIRT1与PCOS的关系SIRT1为Sirtuins家族成员之一，在感知细胞的能量状态中可能起着关键作用[11-13]。SIRT1通过去乙酰化多种蛋白（如组蛋白、转录因子等）修饰的赖氨酸残基，发挥对基因表达的调节作用。在这个过程中，来自乙酰化底物的乙酰基被转移到NAD的ADP-核糖部分，释放出2-O-乙酰-ADP-核糖[14]，并由NAD+/NADH的比率变化控制SIRT1的活性。（1）SIRT1信号通路通过感知和调节细胞氧化还原状态，降低转录因子如NF-κB和AP-1的表达，降低组蛋白的乙酰化修饰水平来发挥抗炎作用[15-16]，从而在体内外为暴露于氧化应激物的细胞和组织提供保护性作用。（2）雷帕霉素及其靶向因子mTOR可通过调节SIRT1信号抑制原始卵泡的发育，从而保留卵泡储备功能[17-18]。SIRT1被认为在与黄体相关的激素生成（大鼠颗粒细胞终末分化）的激活中起到了关键作用[19]。

对于PCOS患者，卵泡发育异常、脂肪代谢紊乱、机体的慢性轻度炎症状态，均提示SIRT1在PCOS的病理过程可能起到重要调控作用。Caglayan等[20]发现PCOS人群的血清SIRT1含量高于健康对照组，猜测这与PCOS人群普遍处于慢性轻度炎症状态相关。然而Tao等[21]在大鼠上却得到了相反的结论，他们认为PCOS大鼠卵巢组织SIRT1表达低于健康对照大鼠，且在二甲双胍治疗后SIRT1的表达上调。本研究显示，PCOS大鼠卵巢中SIRT1蛋白和mRNA水平与正常对照组大鼠相比明显增加。免疫组化显示，SIRT1在颗粒细胞及卵泡膜细胞中均有表达。在PCOS卵巢的形态学观察可见卵泡中卵泡膜细胞细胞层局部凹凸不平，颗粒细胞的层数及细胞数明显减少。因此，我们推测PCOS卵巢因暴露于氧化应激状态使得SIRT1信号通路反应性的增高，从而降低组蛋白的乙酰化修饰水平来发挥抗炎作用。SIRT1的过表达又通过对颗粒细胞、卵泡膜细胞的调控从而抑制卵泡正常发育。

本研究经ELISA测定DHEA组血清TG、LDL水平显著高于NC组，PCOS大鼠存在明显的脂代谢紊乱，提示卵巢SIRT1水平的增高可能与其循环脂质过氧化物的含量增加有关。目前研究普遍认为，PCOS患者脂代谢紊乱与慢性炎症是互为启动、互为因果的关系。白细胞和脂肪组织分泌的细胞因子作用于细胞,刺激机体产生炎症反应，脂肪组织中分泌一些炎症因子诱导巨噬细胞浸润到脂肪组织，导致机体炎症反应[22]。SIRT1保护性的升高，这也与Azza等[23]研究结果一致。

3.3FoxO3a与PCOS的关系FoxO（forkhead box O）转录因子是一类关键的自噬调控因子，以FoxO1、FoxO3的作用最为广泛。其活性主要受SIRT1的去乙酰化调节，在细胞自噬调控中具有重要作用[24]。目前未见FoxO3a对PCOS影响的相关报道。

虽然FoxO3a在大多数哺乳动物组织中高度表达，但在FoxO3a基因敲除后卵巢中观察到明显的紊乱，提示FoxO3a在卵巢功能中具有重要作用。猪卵巢的免疫组化实验表明，颗粒层中的FoxO3a染色比卵母细胞多，表明FoxO3a在颗粒细胞中具有更重要的作用[25]。这也与本研究的免疫组化结果一致。近年研究发现，在卵泡闭锁期间，猪颗粒细胞中FoxO3a的mRNA表达较高。采用TUNEL法和总FoxO3蛋白染色，发现FoxO3蛋白在闭锁卵泡颗粒层高表达。表明FoxO3a在颗粒细胞的凋亡中起到调控作用[25]。本研究显示，PCOS大鼠卵巢中FoxO3a蛋白和mRNA水平与正常对照组大鼠相比明显增加。我们推测FoxO3a的激活诱导颗粒细胞凋亡，进一步导致卵泡闭锁。这是PCOS重要的病理过程，提示其在PCOS的病理发展中起到重要调控作用。而这一作用又受到SIRT1的调节。

综上所述，SIRT1/FoxO3a信号通路在PCOS模型大鼠的病理过程中可能通过调节颗粒细胞发挥作用，这可能与患者体内慢性轻度炎症相关。本研究将为进一步探讨PCOS的发病机制提供一定的理论基础，最终机制有待细胞实验确定。

[1]Fauser BC,Tarlatzis BC,Rebar RW,et al．Consensus on women's health aspects of polycystic ovary syndrome(PCOS)：the Amsterdam ESHRE/ASRM-Sponsored 3rd PCOS Consensus Workshop Group[J]．Fertil Steril,2012,97(1)：28-38．

[2]楼向明,刘文华,汤珊珊,等．NLR、hs-CRP、MPV与肥胖、非肥胖型PCOS的关系[J]．浙江医学,2016,38(4)：248-251．

[3]Kelly CC,Lyall H,Petrie JR,et al．Low grade chronic inflammation in women with polycystic ovarian syndrome[J]．The Journal of clinical endocrinology and metabolism,2001,86(6)：2453-2455．

[4]Zhang R,Liu H,Bai H,et al．Oxidative stress status in Chinese women with different clinical phenotypes of polycystic ovary syndrome[J]．Clin Endocrinol(Oxf),2017,86(1)：88-96．

[5]Schug TT,Xu Q,Gao H,et al．Myeloid deletion of SIRT1 induces inflammatory signaling in response to environmental stress[J]．Molecular and cellular biology,2010,30(19)：4712-4721．

[6]Meng X,Tan J,Li M,et al．Sirt1：role under the condition of ischemia/hypoxia[J]．Cell Mol Neurobiol,2017,37(1)：17-28．

[7]张红艳,岑加萍,刘元伟,等．雌激素上调SIRT1抗衰老机制研究进展[J]．国际妇产科学杂志,2015,42(2)：180-182．

[8]Bordone L,Cohen D,Robinson A,et al．SIRT1 transgenic mice show phenotypes resembling calorie restriction[J]．Aging cell,2007,6(6)：759-767．

[9]Coussens M,Maresh JG,Yanagimachi R,et al．Sirt1 deficiency attenuates spermatogenesis and germ cell function[J]．PLoS one,2008,3(2)：e1571．

[10]Seifert EL,Caron AZ,Morin K,et al．SirT1 catalytic activity is required for male fertility and metabolic homeostasis in mice[J]．FASEB journal：official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology,2012,26(2)：555-566．

[11]Carafa V,Rotili D,Forgione M,et al．Sirtuin functions and modulation：from chemistry to the clinic[J]．Clin Epigenetic,2016,8：61．

[12]Houtkooper RH,Canto C,Wanders RJ,et al．The secret life of NAD+：an old metabolite controlling new metabolic signaling pathways[J]．Endocrine reviews,2010,31(2)：194-223．

[13]Canto C,Auwerx J．Targeting sirtuin 1 to improve metabolism：all you need is NAD(+)?[J]．Pharmacological reviews,2012,64(1)：166-187．

[14]Verdin E．The many faces of sirtuins：Coupling of NAD metabolism,sirtuins and lifespan[J]．Nature medicine,2014,20(1)：25-27．

[15]Lin QQ,Yan CF,Lin R,et al．SIRT1 regulates TNF-alpha-induced expression of CD40 in 3T3-L1 adipocytes via NF-kappaB pathway[J]．Cytokine，2012,60(2)：447-455．

[16]Matsushita T,Sasaki H,Takayama K,et al．The overexpression of SIRT1 inhibited osteoarthritic gene expression changes induced by interleukin-1beta in human chondrocytes[J]．Journal of orthopaedic research：official publication of the Orthopaedic Research Society,2013,31(4)：531-537．

[17]Luo LL,Chen XC,Fu YC,et al．The effects of caloric restriction and a high-fat diet on ovarian lifespan and the expression of SIRT1 and SIRT6 proteins in rats[J]．Aging clinical and experimental research,2012,24(2)：125-133．

[18]Zhang XM,Li L,Xu JJ,et al．Rapamycin preserves the follicle pool reserve and prolongs the ovarian lifespan of female rats via modulating mTOR activation and sirtuin expression[J]．Gene,2013,523(1)：82-87．

[19]Morita Y,Wada-Hiraike O,Yano T,et al．Resveratrol promotes expression of SIRT1 and StAR in rat ovarian granulosa cells：an implicative role of SIRT1 in the ovary[J]．Reproductive biology and endocrinology：RB&E,2012,10：14．

[20]Kiyak Caglayan E,Engin-Ustun Y,Gocmen AY,et al．Serum sirtuin 1 levels in patients with polycystic ovary syndrome[J]．Journal of obstetrics and gynaecology：the journal of the Institute of Obstetrics and Gynaecology,2015,35(6)：608-611．

[21]Tao X,Zhang X,Ge SQ,et al．Expression of SIRT1 in the ovaries of rats with polycystic ovary syndrome before and after therapeutic intervention with exenatide[J]．International journal of clinical and experimental pathology,2015,8(7)：8276-8283．

[22]王秋毅,冯桂梅,王薇,等．青春期和育龄期多囊卵巢综合征的临床生化特征分析比[J]．现代妇产科进展,2013,8(8)：647-650．

[23]Abd Elwahab AH,Ramadan BK,Schaalan MF,et al．A Novel Role of SIRT1/FGF-21 in Taurine Protection Against Cafeteria Diet-Induced Steatohepatitis in Rats[J]．Cellular physiology and biochemistry：international journal of experimental cellular physiology,biochemistry,and pharmacology,2017,43(2)：644-659．

[24]Ferdous A,Battiprolu PK,Ni YG,et al．FoxO,autophagy,and cardiac remodeling[J]．Journal of cardiovascular translational research,2010,3(4)：355-364．

[25]Pelosi E,Omari S,Michel M,et al．Constitutively active Foxo3 in oocytes preserves ovarian reserve in mice[J]．Nat Commun,2013,4：1843．