郭娜娜，刘学军，杜毓峰，郝小燕，张帆，林白阳，郭慧

（1.山西医科大学，山西 太原 030000；2.山西医科大学第一医院老年病科，山西 太原 030001）

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，呈现年轻化趋势[1]，且出现消化道症状及营养不良，因此肺与肠的关系成为该研究的切入点。中医理论赞同肺肠具有相同的黏膜免疫机制，近年对肠屏障损伤的研究多在休克、烧伤、严重创伤以及多器官功能障碍综合征等急性重症中进行，并多将损害归因于局部肠黏膜缺血、缺氧和肠内营养底物缺乏。但有关肺癌对肠黏膜屏障影响的规律和机制研究却少见报道。目前自由基与肺癌的关系成为研究热点[2]，为了解肺癌合并肠黏膜屏障功能障碍是否与自由基有关，设计小鼠肺癌模型试验，通过测定血清MDA水平，光镜下观察小鼠小肠组织的病理形态，分析肠黏膜紧密连接蛋白ZO-1、Occluden-1的表达，综合分析肺癌对肠黏膜屏障的影响。

1 材料与方法

1.1 临床材料

1.1.1 实验动物 健康C57BL/6雄性小鼠（6周龄）16只（北京维通利华实验动物技术有限公司，体质量20～25 g，动物协议由实验动物伦理委员会进行审查和批准，饲养于温度稳定在18～20℃，12小时明暗周期的塑料笼中，自由摄食饮水）。

1.1.2 主要材料及试剂 Lewis肺癌细胞（LLC）从上海细胞生物学研究所（上海，中国）购得；10%胎牛血清；DMEM培养基；0.25%胰酶、血清试剂盒由南京建成生物公司提供；一抗：多克隆兔抗Occludin抗体，多克隆兔抗ZO1抗体购于武汉博士德公司；二抗：辣根酶标记山羊抗兔IgG购于北京诺博莱德科技有限公司、SABC免疫组化染色试剂盒购于中杉金桥公司；实验中所用的是Scanscope数字病理扫描系统。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及处理 将实验动物适应性饲养1周后，随机分为2组:A组为正常对照组（8只），B组为实验肺癌模型组（8只）。在小鼠模型制备之前（约2 d），为避免局部伤口感染，给予肌注青霉素2万单位和链霉素50 mg/（只·d）。

1.2.2 肺癌模型制备

（1）LLC细胞培养 用DMEM培养基（加10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素）于5%CO2、37℃无菌培养箱中按1:2分瓶传代培养，取对数生长期的细胞培养作为实验后续使用。

（2）造模 通过查阅文献发现皮下接种成瘤率高，因此本实验将离心（1 000 rpm,5 min）收集的LLC细胞经PBS洗涤调整细胞浓度后，使用1 ml注射器抽取约1 ml（1×106个/只）细胞悬液逐个注入以乙醚麻醉的B组小鼠的右前肢腋下，接种后7 d可扪及小结节，于14 d、21 d可见肿瘤明显增大，平均长径约2 cm，最大长径为2.7 cm，肿瘤质地韧，光镜下观察肺组织HE染色病理结果，确定造模成功。

1.3 取材 取造模成功小鼠即肺癌模型组的心脏血、肺、回盲部上端10 cm小肠组织，将血样离心后，提取血清储存于-80℃冰箱，将肺、小肠经10%福尔马林固定，脱水、石蜡包埋。

1.4 指标测定

1.4.1 小鼠体态变化 观察小鼠活动状态、皮毛光泽。

1.4.2 小鼠肺功能检测 选取成瘤小鼠，在处死取材之前进行游泳实验，记录小鼠置于水桶至头低于水面以下的时间，可间接反映肺癌小鼠的肺功能变化。

1.4.3 肺组织形态学观察 将石蜡包埋的肺组织切片行HE染色，光镜下观察各组肺组织变化。

1.4.4 血清测定 测定血清中MDA：MDA是机体发生炎症反应时细胞释放大量自由基，进而发生脂质过氧化的产物；当肠黏膜通透性增加，MDA可释放入血，作为间接反映肠黏膜屏障功能受损程度及通透性的生化指标[3]。

1.4.5 小肠黏膜形态学指标 HE染色：肠道的石蜡组织包埋后切片，分别严格按照标准操作流程及试剂说明书进行小肠组织切片HE染色。光镜下观察小肠组织形态学改变。

1.4.6 免疫组化染色 ZO-1蛋白、Occluden-1蛋白是细胞间重要的紧密连接蛋白，可反映肠道黏膜屏障上皮细胞紧密连接的完整性[4]。检测小肠组织中ZO-1蛋白、Occluden-1蛋白的表达水平，采用SABC法，按试剂盒说明书操作，抗体孵育后DAB显色，阳性结果为棕黄色，应用病理图像分析系统采集并分析图像。

1.5 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件对所收集的数据进行整理分析。数据用“”表示,组间比较采用单因素方差分析,以P＜0.05作为差异有统计学意义标准。

2 结果

2.1 小鼠体态变化 A组正常对照组小鼠毛发光亮、一般情况较前无差异；B组实验肺癌模型组小鼠毛发暗沉、身材消瘦、活动明显减少、呼吸浅快。

2.2 小鼠肺功能检测 测定小鼠游泳实验中持续时间，间接反映小鼠肺功能变化，B组小鼠游泳持续时间明显低于A组，提示B组小鼠的肺功能差于A组，可知肺癌对小鼠的肺功能有明显影响，见表1。

表1 两组小鼠游泳时间比较（）Table 1 Two groups of mice swimming time comparison()

表1 两组小鼠游泳时间比较（）Table 1 Two groups of mice swimming time comparison()

游泳时间20.42±1.27 9.76±0.55＜0.05组别A组B组P值数量8 8

2.3 各组小鼠肺组织HE染色形态学观察情况的比较 A组光镜下未见癌组织，B组光镜下可见癌组织，表现为核异型性明显，核裂解，细胞体积增大及形状不规则，排列紊乱。提示造模成功，见图1，图2。

图1,2 分别为A组、B组小鼠肺组织HE染色（×200）Figure1,2 groupA,group B mouse lung tissue HE staining(×200)

2.4 血清测定MDA的结果见表2。

表2 两组小鼠血清测定MDA的结果比较（）Table 2 Two groups of mice serum MDAresults compared()

表2 两组小鼠血清测定MDA的结果比较（）Table 2 Two groups of mice serum MDAresults compared()

MDA 60.56±2.04 51.64±1.77＜0.05组别A组B组P值例数8 8

2.5 小肠黏膜HE染色形态学 A组肠黏膜连续、完好；B组肠微绒毛紊乱、黏膜下固有层间隙胶原纤维增生、隐窝增生。提示肺癌小鼠存在肠黏膜损伤，见图3，图4。

图3,4 分别为A组、B组小鼠小肠组织HE染色（×100）Figure 3,4 HE staining of small intestine tissue of group Aand group B(×100)

2.6 两组小肠组织中ZO-1蛋白、Occluden-1蛋白表达水平 A组ZO-1蛋白在小肠上皮组织胞浆大量表达呈棕褐色，B组胞浆染色范围较分散及染色程度较弱，见图5，图6。

2.7 两组小鼠小肠组织Occluden-1蛋白表达情况 A组Occluden-1蛋白在小肠上皮细胞大量表达呈棕褐色；B组Occluden-1蛋白在小肠上皮细胞染色较弱，见图7，图8。

图5,6 分别为A组、B组小鼠肠道免疫组化ZO-1蛋白表达（×100）Figure5,6 show the expression of ZO-1 protein in intestinal tract of mice in groupAand group B respectively(×100)

图7,8 为A组、B组小鼠小肠组织Occluden-1蛋白表达情况（×100）Figure 7,8 show the expression of Occluden-1 protein in small intestine of mice in groupAand group B(×100)

3 讨论

随着环境污染、社会老龄化、生活习惯等多种因素的影响，肺部疾病发病率及死亡率呈明显上升趋势，导致原发疾病急性加重的主要原因是感染，因而导致患者感染的病因机制逐渐成为研究突破点。O’Dwyer等[5]在《Nature》上最新发表的《肺微生物，免疫和慢性肺病的发病机制》中阐述了慢性肺部疾病加重时宿主的防御调节以及肠-肺轴的证据和影响，认为肠的细菌生物量与肺中的相对质量相差很小，肺部疾病进程和易感性受肠道微生物群组成变化的影响。此外，在没有正常的肠道生物群的情况下，宿主对肺部感染更容易感染[6]；呼吸道和胃肠道具有共同黏膜免疫系统的组成部分，蛋白酶调控、免疫细胞在呼吸道、肠道中均发挥重要作用。本实验通过制备小鼠肺癌模型，证实肺癌对肠黏膜屏障的损伤机制，进一步验证关于肠-肺的黏膜免疫学说，为今后肺部疾病患者的预后及防治提出新的思路。

上皮屏障功能的维持是维持呼吸道和胃肠道黏膜健康状态的关键。这是因为上皮屏障将黏膜间质和底层组织与黏膜腔中抗原物质的环境隔开。因此，由于黏膜炎症而导致的屏障功能丧失导致了这些疾病的慢性发展，尚不清楚功能丧失是否是疾病的致病因素或后果[7]。肺部疾病常伴有消化道症状，有研究认为肺部疾病患者机体长期缺氧诱导一系列炎症反应，释放氧自由基、炎性因子等加剧肠黏膜的损伤[8-9]；机体处于低氧状态，而肠道因特殊的解剖结构对缺氧最敏感，使肠道黏膜通透性增加，导致肠道细菌移位通过肠腔入血[10]。本实验通过检测血清中MDA的含量、肠黏膜厚度以及通过观察小肠组织中紧密连接蛋白ZO-1、Occluden-1的表达水平证实了肺癌小鼠存在肠黏膜损伤，探究了肠黏膜损伤的机制。

本实验的研究存在一些局限性：①肺癌肠黏膜的改变可能涉及多种因素，目前对肺癌引起的肠黏膜损伤的研究尚无，本实验设计思路源于临床观察发现肺癌患者常伴有消化道症状；②本实验仅研究了肠黏膜损伤的其中一个机制，即缺血、缺氧对肠黏膜屏障的影响，且仅涉及了机械屏障的改变，尚未对肠黏膜屏障的免疫屏障、生物屏障等进行探索；③肠黏膜受损与肠道微生物分布及数量具有相关性，本实验未进一步探索这一点；④本实验仅通过游泳试验间接反映肺癌小鼠肺功能的改变，未能准确评估小鼠缺氧程度，需进一步评估不同缺氧程度对肠黏膜损伤情况。综上，肠黏膜屏障的损伤受多种因素影响，其损伤机制也不同，并且肺部疾病与肠道密切相关，因此肺部疾病对肠黏膜屏障的影响将成为今后研究热点。

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