蒋丽 李辉 张桂英 穆仪冰 刘海涛

胃癌在我国发病率较高，随着诊治技术的提高预后大为改善，但晚期患者仍缺乏有效治疗手段。自体细胞免疫治疗作为肿瘤重要的辅助疗法成为新的关注点[1～3]，包括树突状细胞（Dendritic cell，DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine induced killer cells，CIK）[4]，可打破机体免疫耐受、诱导凋亡、杀伤残余肿瘤细胞，延长生存期。但当前面临的问题是肿瘤患者体内DC功能不全，无法有效提呈抗原及诱导后续免疫反应；且大部分肿瘤缺乏特异性及稳定性好的抗原来刺激DC分化成熟，导致抗肿瘤治疗收效甚微[5]。本实验拟通过聚乙二醇（PEG）法制备DC-自体胃癌细胞融合疫苗[6]，刺激DC分化及实现其对胃癌细胞抗原的全部提呈，采用分组对比，将融合疫苗、DC和胃癌细胞分别与CIK细胞共培养后观察CIK细胞亚群表达率、混合培养细胞对胃癌细胞凋亡的影响及凋亡相关蛋白的表达，探讨DC融合疫苗-CIK细胞的离体抗肿瘤效应及可能机制，为临床开展晚期胃癌自体细胞免疫治疗提供新的思路和研究基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂 人外周血淋巴细胞分离液（LTS1077）：天津灏洋生物有限公司，聚乙二醇（YB120644-100）：上海钰博生物科技有限公司，HAT筛选培养基（19-0090-500）：上海信裕生物科技有限公司，重组人纤粘连蛋白RetroNectin（T100B）、淋巴细胞、DC细胞无血清培养基（GT-T551）：宝日医（TAKARA）北京有限公司。CD86-FITC单抗（ab24862）、CD80-FITC 单抗（ab18279）、CD44-PE 单抗（ab46793）、CD3-FITC单抗（ab34275）、CD56-PE 单抗（ab210305）、CD8β-PE单抗（ab95769）：艾博抗（Abcam）上海贸易有限公司。台盼蓝染色液（PH0519）、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（PH0539）：福州飞净（PHYGENE）生物科技有限公司。兔抗人RKIP单抗（#13006）、NF-κB p65单抗（#8242）、Caspase-8单抗（#4790）、兔抗人β-actin单抗（#4970）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG二抗（#7074）：美国Cell Signaling Technology（CST）公司。Western blot试剂盒（WB0411）：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 自体胃癌细胞的制备[7]收集2016年10月～2017年8月我院消化内科和普外科住院及门诊患者20例，其中男12例，女8例，年龄40～96岁，平均（62.15±3.15）岁，结合临床资料、胃镜+病检确诊为进展期胃癌。检查前未行放化疗，标本采集获得患者知情同意，相应细胞组分分别编号1～20。胃镜下活检钳取肿瘤组织2～3块，部分标本送病检，其余均匀涂布于25ml培养瓶底，加入含10﹪胎牛血清的RPMI1640培养基，于37℃、5﹪CO2温箱中培养，定期换液，当观察到细胞铺满度为90﹪时，0.25﹪胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，待培养至对数期生长状态，冻存。

1.2.2 DC的提取与鉴定 分离患者外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），具体操作步骤见前期研究[8]，将悬浮细胞选择性去除巨噬细胞、B细胞、NK细胞及细胞毒性T细胞（CTL），余下T细胞用来培养CIK。贴壁细胞培养7d收获未成熟DC。

1.2.3 胃癌细胞/DC融合疫苗的制备及鉴定 具体操作步骤见前期研究[8]，采用PEG法融合[9]，HAT培养基筛选融合疫苗。CD86-FITC单抗（绿色）标记DC、CD44-PE单抗（红色）标记胃癌细胞，荧光显微镜下观察双染细胞形态，流式细胞仪（FCM）测定双阳性细胞即成功融合细胞比率，并比较融合DC和未融合DC表面CD80、CD86的表达差异。

1.2.4 CIK细胞制备 用PBS液将前述分离的T细胞混悬，2 000r/min离心10min，洗涤，将细胞调至2×106/ml，加入 24孔培养板（终体积 1ml/孔），加入rhIFN-γ（1 000U/ml），24h后依次加入rhIL-1 （500U/ml）、rhIL-2 （500U/ml）、CD3单抗（100ng/ml），在37℃、5﹪CO2温箱中培养，每隔3d换液，只补充同等剂量的rhIL-2。培养7～10d，使CIK细胞总数达2×109/ml，台盼蓝染色，拒染细胞比例＞95﹪。收集细胞，采用1﹪白蛋白生理盐水洗涤两遍后悬浮其中[10]。

1.2.5 各组细胞与CIK细胞混合培养 将CIK细胞转入培养瓶，加50ml GT-T551无血清培养基及rhIFN-γ（1 000U/ml），24h 后将悬浮细胞转入已包被RetroNectin的培养瓶中，加入 rhIL-2（1 000U/ml）、rhIL-1α（100U/ml）和GT-T551培养基（加入2﹪自体血清），5d后转入培养袋中，每3～5d添加培养基和rhIL-2。实验分为3组，DC-胃癌细胞融合疫苗组（融合组）、DC组、胃癌细胞组（胃癌组），每组均为20例入选患者的相应细胞组分。将各组细胞按1∶40的比例混入同编号CIK细胞培养袋中。第14天收集混合培养细胞，行CIK细胞免疫表型测定：PBS洗涤培养细胞两次，调整细胞浓度为5×106/ml，各取100μl加入离心管，再加入各标记单抗20μl，置暗处4℃反应30min后，PBS洗涤两次，FCM测定CD3-FITC/CD8-PE、CD3-FITC/CD56-PE双阳性细胞比率[4]。

1.2.6 各组混合培养细胞对人自体胃癌细胞凋亡影响的检测 以1×106/ml接种对数生长期胃癌细胞于6孔板，于37℃、5﹪CO2温箱培养生长，随后将相同密度的3组混合细胞放入6孔板与同编号胃癌细胞共培养5～15d，按照试剂盒说明，在凋亡诱导结束后，PBS洗涤，胰酶消化解离细胞，1 500r/min离心5min，弃上清，PBS重悬、计数。取1×106细胞悬浮液，1 500r/min，离心5min后弃上清，加入500μl 1×Binding Buffer，加入5μl Annexin V-FITC，再 加入10μl PI，轻轻混匀。室温使用铝箔避光孵育5～15min。在1h内行FCM检测早期凋亡细胞百分率（使用未经凋亡诱导的胃癌细胞作对照，进行荧光补偿调节）。另取一滴细胞悬浮液于载玻片上，盖玻片观察。采用双色滤光片，Annexin V-FITC荧光呈绿色，PI荧光呈红色[11～13]。

1.2.7 RKIP、NF-κB、Caspase-8蛋白表达的检测 采用Western blot法，将作用后的胃癌细胞经胰酶消化，制成单细胞悬液，3 000r/min离心3min，收集沉淀，按照6孔板每孔加入100μl RIPA裂解液，反复吹打混匀，冰上静置30min，12 000r/min离心3min，取上清。提取少量样品行BCA定量，其余蛋白样品煮沸变性，存于-20℃冰箱中备用。灌制分离胶和积层胶，加样（20μl每孔）、电泳、切胶、转PVDF膜，转好的膜置于5﹪脱脂奶粉中封闭2h，加入一抗（RKIP、NF-κB p65、Caspase-8，稀释比例均为 1∶1000），4℃过夜孵育，冲洗3次，加HRP标记的二抗（稀释比例为1∶3000），室温孵育 1h，彻底冲洗 3次，ECL 显色、定影、冲洗晾干、照相。β-Actin作内参。取目的条带与内参条带灰度值比值为相对表达量[14～16]。

1.3 统计学分析 数据分析采用SPSS 22.0统计软件，实验均重复3次，计量资料以±s表示。多组数据比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用两独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 融合率检测及融合前后DC表面分子表达比较 荧光显微镜下观察，诱导融合之后的DC体积增大、毛刺多而密，呈现典型的成熟DC形态。胃癌细胞与DC的融合率为26.2﹪；融合DC较未融合DC高表达CD80[（84.50±2.07）%vs （24.70±1.49）﹪，t=74.11，P=0.000]和CD86[（76.50±1.58）﹪ vs（18.90±1.19）﹪，t=91.84，P=0.000]，见图1。

2.2 CIK细胞亚群免疫表型检测 3组细胞与CIK细胞混合培养后，CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞百分比比较差异有统计学意义（P＜0.05）；融合组与另外两组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），DC组与胃癌组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见图2、表1。

图1 融合率检测及融合前后DC表面分子表达

2.3 各组混合培养细胞对自体胃癌细胞凋亡的影响 胃癌组、DC组、融合组自体胃癌细胞凋亡率依次上升（见图3）；RKIP、Caspase-8蛋白相对含量表达依次上调；NF-κB蛋白相对含量表达依次下调（见图4），3组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；融合组与DC组及胃癌组上述各指标比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；DC组与胃癌组上述各指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

图2 CIK细胞亚群免疫表型检测

图3 胃癌细胞与各组混合培养细胞作用后凋亡情况

图4 Western-blot法检测RKIP、NF-κB、Caspase-8蛋白表达

表1 3组混合培养细胞对自体胃癌细胞的影响（±s）

表1 3组混合培养细胞对自体胃癌细胞的影响（±s）

组别 CD3+CD8+（﹪） CD3+CD56+（﹪） 凋亡率（﹪） RKIP/β-Actin NF-κB/β-Actin Caspase-8/β-Actin融合组 62.60±4.27 30.55±3.25 18.40±4.17 1.96± 0.49 0.88±0.19 0.85±0.20 DC 组 50.20±4.85 23.75±3.47 9.25±3.64 1.26±0.26 1.56±0.12 0.53±0.12胃癌组 47.10±5.01 21.00±5.28 7.15±3.18 1.19±0.44 1.68±0.24 0.43±0.20 3组比较 *F 60.29 28.68 52.63 21.05 101.58 29.89 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000融合组与DC组比较t 8.58 6.39 7.39 5.54 -13.32 6.08 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000融合组与胃癌组比较t 10.52 6.89 9.59 5.18 -11.63 6.56 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 DC组与胃癌组比较t 1.99 1.95 1.94 0.63 -2.01 1.92 P 0.054 0.059 0.060 0.533 0.052 0.063

3 讨论

对于晚期胃癌患者，手术切除率低、术后转移或复发率高；放化疗效果欠佳、毒性反应大[17]。而免疫治疗尤其是自体细胞免疫治疗因针对肿瘤患者因人施治，完全符合肿瘤个体化治疗标准，其中以DCCIK细胞免疫治疗为国内外研究的热点[4]。DC因其专职抗原呈递、激活初始T细胞，在诱导抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用。CIK系多种细胞因子共刺激、培养T细胞后获得的异质细胞群，可不需要其他辅助细胞和因子即可发挥强大的杀伤肿瘤细胞作用。主要由CD3+CD56+和CD3+CD8+亚群组成。DC-CIK疗法是将活性DC与CIK混合培养后回输至患者体内，通过免疫调节进行抗肿瘤治疗[18，19]。但研究表明[5]，肿瘤患者体内DC数量少、功能严重缺陷，无法诱导后续免疫反应。如何有效刺激诱导DC增殖成熟、提呈抗原以及如何高效杀灭体内残存癌细胞是目前面临的两大关键问题。

由于大多数肿瘤并未发现相关性及特异性较好的抗原，只能采取全细胞抗原来刺激DC增殖分化成熟。DC与肿瘤细胞融合技术能确保DC获得肿瘤细胞全部信息、呈递多种肿瘤抗原，诱导特异性细胞免疫应答。目前常用融合技术有电融合法[20]和PEG化学方法[9]。由于电脉冲会造成膜的可逆击穿、细胞内容物外泄这一缺陷，部分限制了此类技术的应用，目前广泛采用的仍是操作较简单经济的PEG法。庞业滨等[9]采用PEG法制备肝癌HepG2细胞与DC融合疫苗，发现融合率为54.5%，融合疫苗表面高表达DC成熟分子，与单纯DC、HepG2和DC混合细胞组相比差异有统计学意义。我们应用PEG法制备胃癌细胞-DC融合疫苗，FCM检测该融合细胞呈CD86+CD44+双阳性，证明融合成功，融合率为26.2﹪，与上述报道中融合率不同，考虑为肿瘤细胞类别差异所致。且融合DC较未融合DC高表达CD80、CD86成熟分子，与上述报道结果一致，证明了融合疫苗促进DC本身的成熟。分组采用混合细胞与CIK细胞共培养，融合组CIK细胞CD3+CD56+和CD3+CD8+细胞比例较DC组和胃癌组明显升高，而DC组和胃癌组相比无统计学差异，既验证了肿瘤患者体内DC功能缺陷，诱导免疫效应能力不足，又进一步揭示了融合疫苗可促进CIK细胞的成熟。

林兴等[13]用PEG法制备DC肺癌细胞融合疫苗，发现其有诱导小鼠移植瘤细胞凋亡的作用。本实验采用Annexin V-FITC/PI染色法较特异地区分凋亡细胞和坏死细胞，发现融合组较其他两组胃癌细胞的凋亡率增高，而DC组和胃癌组凋亡率相比无统计学差异，从细胞水平也验证了DC融合疫苗联合CIK可有效对抗晚期肿瘤，与已有结论相似。

研究报道[14，15]，RKIP同肿瘤细胞的凋亡存在密切关系，张晓梅等[21]采用脂质体转染技术将RKIP真核表达重组质粒pcDNA3.1（＋）/RKIP导入胃癌细胞系SGC7901，发现转染后SGC7901细胞系诱导细胞凋亡增加，RKIP基因重表达有助于该细胞系恶性表型逆转。RKIP诱导凋亡是通过多条信号通路调控的，如对NF-κB信号通路的调控。NF-κB是公认的拮抗凋亡转录调节因子，既可在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）凋亡信号传导过程中通过上调诱骗受体起负向调节作用，也可激活抗凋亡基因cFLP，因cFLP碳末端含有两个类似Caspase蛋白的死亡效应域，可竞争性招募某些死亡域，造成Caspase失活、凋亡受阻[16，22，23]。Su 等[24]发现 RKIP 影响 NF-κB 的上游，抑制诸如NIK、TAK1、IKKα/β等多种激酶，从而抑制NF-κB转录。沉默RKIP表达促进NF-κB转录及减少细胞凋亡。另外，Baritaki等[25]发现RKIP在肿瘤中表达很少，促进其过表达可以通过上调TRAIL受体DR5（death recepter 5）来促进凋亡。当TRAIL与其受体DR5结合后三聚化，通过其胞内段的死亡结构与Fas相关死亡结构域（FADD）及pro-Caspase-8形成死亡信号诱导复合物，导致Caspase-8活化，而Caspase-8位于细胞凋亡级联反应的顶点，继而激活下游效应Caspase，如 Caspase-3、6、7。本研究结果显示，融合组较其他两组 RKIP、Caspase-8 蛋白表达上调，NF-κB蛋白表达下调，与凋亡率变化相一致，提示可能通过上调RKIP、抑制NF-κB从而上调Caspase-8，促进胃癌细胞凋亡，起到抗肿瘤效应。本研究证明了DC融合疫苗-CIK细胞作用的可行性，为临床进行个体化抗肿瘤免疫治疗提供了依据。

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