付 欣，鲁 明，王小鹤，于 淼

（辽宁省农业科学院 食品与加工研究所，沈阳 110161）

黑米为米中珍品，入口香甜醇厚，质地好。黑米营养丰富，含有黑米色素、氨基酸、B族维生素、蛋白质、矿物元素等功能性成分，而白米中的这些成分几乎不含或含量较少。但黑米口感粗糙，降低了人们对它的喜爱程度。研究表明，发芽处理可使黑米组织软化，提高加工性、适口感和商品价值。以黑米为原料，采用不同条件进行黑米发芽，根据发芽过程中的蛋白酶活力变化，确定黑米发芽的最佳工艺条件，以期为黑米发芽工艺提供理论基础和参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑米由辽宁省稻作研究所提供。

三氯乙酸（TCA）、磷酸二氢钠、氯化钙均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司生产。醋酸缓冲液（pH3.6）标准品，由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产。

1.2 仪器与设备

紫外分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；LXJ-ⅡB型离心机：上海安亭科学医学仪器厂；电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂；电子天平：北京赛多利斯仪器有限公司；HH-601A型水浴锅：江苏金坛荣华仪器公司

1.3 单因素试验

1.3.1 黑米发芽处理方法取筛选除杂后的黑米，用0.5%的次氯酸钠溶液浸泡30 min，再用去离子水冲洗。待糙米表面干燥后，分别用0.5 mmol／L氯化钙（Ca2+）和自来水浸泡24 h，每隔8 h捞出放置1 h。

在培养皿中放置3层纱布，再放入处理好的黑米，用3层纱布盖在表面，置于培养箱内（黑暗条件下）发芽。每天在表面喷洒1～2次水，确保黑米处于湿润状态。每个试验重复3次。

1.3.2 浸泡温度、时间对黑米吸水率的影响将黑米样品分成4份，用纱布包好，放入装有无菌水的烧杯中，分别置于20，25，30，35℃恒温水浴锅，每4 h取出晾干称重，计算黑米的吸水率。

1.3.3 浸泡温度、时间对黑米发芽率的影响取黑米样品4份，分别放入 20，25，30，35 ℃的无菌水中浸泡，每隔6 h定量取出，在22℃培养箱中发芽48 h，计算发芽率。

1.3.4 前处理Ca2+浓度对蛋白酶活力的影响取20 g黑米样品7份，分别放入100 mL无菌水，以及灭菌后的0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mmol／L Cacl2溶液中， 于 28℃下浸泡24 h，放入培养箱（22℃）发芽，测定其蛋白酶活力。

1.3.5 温度对蛋白酶活力的影响取 300 g黑米样品，用28℃的1 000 mL无菌水浸泡24 h；取出，分成等重6份， 分别置于 14，18，22，26，30，34 ℃的培养箱发芽，考察发芽温度对黑米蛋白酶活力的影响。

1.3.6 时间对黑米发芽过程中蛋白酶活力的影响取350 g黑米，在28℃下用1 000 mL无菌水浸泡24 h；取出，分成等重7份，放入22℃培养箱中发芽，在1，2，3，4，5，6，7 d 分别取出一份发芽黑米，测定蛋白酶活力，考察发芽时间对黑米蛋白酶活力的影响。每个试验重复3次。

1.4 响应面法试验设计

在单因素试验的基础上，选取3个影响最显著的因素为自变量，应用Box-Behnken设计响应面试验，设计因素水平见表1。采用Design-Expert8.0.5b对试验数据进行优化分析。

表1 响应面设计因素水平Table 1 Factor levels of RSD

1.5 蛋白酶活力测定

1.5.1 酪氨酸标准曲线取 18支试管，分成 6组（每组3支，平行样）并编号，分别加入标准酪氨酸、去离子水、浓度0.4 mol／L的碳酸钠溶液和福林-酚试剂，混匀，置于40℃水浴保温20 min，用分光光度计进行比色测定（波长660 nm）。以酪氨酸反应液作为空白对照，绘制标准曲线。

1.5.2 蛋白酶活力测定方法参照Harvey等的测定方法并稍做修改。称取2.00 g发芽黑米，冰浴条件下加8 mL醋酸缓冲液研磨匀浆，在4℃、10 000 r／min条件下离心30 min，上清液即为蛋白酶粗提液。

在40℃下取酪蛋白底物、蛋白酶粗提液各1 mL，保温10 min，在90℃水浴条件下灭酶5 min，加入 0.4 mol／LTCA溶液 2 mL， 常温下放置 15 min沉淀残余蛋白质，4 500 r／min离心15 min，取上清液，在波长275 nm处测定吸光值。

以酪氨酸为标准，将1.00 g发芽黑米蛋白酶粗提液催化酪蛋白每分钟产生1 μg酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位（U）。以反应前先加入TCA溶液的体系为对照。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 温度和前处理对黑米芽长的影响脱壳后的黑米是完整的植物种子，富含营养物质和生命物质，在适宜的温度、水分条件下就会发芽。不同发芽温度及前处理方法对黑米芽长的影响见表2。

表2 黑米发芽过程中的芽长变化Table 2 Bud length change during germination of black rice ／mm

由表2得出，黑米在温度较高的环境中长芽更快，芽长更长。在22℃条件下，用Ca2+处理的黑米比用去离子水处理的黑米长芽趋势好。

2.1.2 浸泡温度和时间对黑米吸水率的影响适宜的浸泡温度和时间，利于黑米充分吸水，浸泡温度和时间对黑米吸水率的影响见图1。

图1 浸泡温度和时间对吸水率的影响Figure 1 Effect of immersion temperature and time on the water absorption rate of black rice

从图1可以看出：浸泡温度和浸泡时间对黑米的吸水率影响较大；随着浸泡温度的提高，黑米吸水饱和时间逐渐缩短；在35℃下浸泡25 h后，黑米的吸水率基本达到饱和。

2.1.3 浸泡温度和时间对黑米发芽率的影响发芽率与浸泡温度、浸泡时间的关系见图2。

图2 浸泡温度和浸泡时间对发芽率的影响Figure 2 Effect of immersion temperature and time on the germination rate of black rice

由图2可知：当浸泡时间为6～18 h时，随着浸泡温度的提高，黑米的发芽率有小幅度增加；在35℃下浸泡 18 h、25～30℃浸泡 24 h、20℃浸泡 30 h后，发芽率达到最高值；此后，随着浸泡时间的延长，发芽率反而降低。综合考虑，选择浸泡温度25～30℃，浸泡时间20～24 h为宜。

2.1.4 Ca2+浓度对蛋白酶活力的影响在 22℃条件下，将不同浓度Ca2+浸泡的黑米放入培养箱 （黑暗条件）发芽。Ca2+浓度对蛋白酶活力的影响见图3。

图3 不同Ca2+浓度对蛋白酶活力的影响Figure 3 Effect of different Ca2+concentration on protease activity

如图 3 所示，当 Ca2+浓度低于 0.6 mmol／L 时，黑米中的蛋白酶活力随Ca2+浓度增高逐渐增加；当Ca2+浓度大于0.6 mmol／L时，蛋白酶活力逐渐降低。所以选择0.6mmol／L的Ca2+进行黑米发芽前处理。

2.1.5 温度对蛋白酶活力的影响温度对蛋白酶活力的影响见图4。

图4 不同温度对蛋白酶活力的影响Figure 4 Effect of different temperatures on protease activity

由图4可知：发芽期间，黑米蛋白酶活力随着温度升高而显著增加，在22℃时达最大值，之后开始下降。因此选择22℃作为黑米发芽温度。

2.1.6 时间对蛋白酶活力的影响发芽时间对黑米发芽过程中蛋白酶活力的影响如图5所示。

图5 不同发芽时间对黑米发芽过程中蛋白酶活力的影响Figure 5 Effect of different germination time on protease activity of black rice during germination

由图5可知：蛋白酶活力随着发芽时间的增加总体呈上升趋势，在第5 d达到最大值，之后逐渐降低。最佳发芽时间为5 d。

2.2 响应面试验设计

响应面试验设计及结果见表3。利用Design-Expert8.0.5b对试验数据进行优化分析，得出3因素与蛋白酶活力（Y）之间的回归方程式：

Y ＝350.58+11.19A+25.59B+21.63C-2.25AB-2.87AC-14.43BC-41.64A2-74.64B2-63.81C2响应面试验方差分析结果见表4。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of RSD test

表4 响应面试验方差分析结果Table 4 Variance analysis results of RSM test

P值的大小体现显著性检验结果，当模型P值小于0.05时，表明在统计学上是有意义的。通过表4结果可知，该模型 P＜0.05，说明具有统计学意义，且二次项 A2，B2，C2极显著（P＜0.0001）。

失拟项表示所用模型与试验拟合的程度，表4中的失拟项 P 值为 0.8956＞0.05，表明失拟不显著。 模型的校正决定系数 R2adj＝0.9834，说明模型能解释约98.34%响应值的变化；决定系数 R2＝0.9927，说明模型拟合度较好，试验误差小，可以利用该回归方程确定黑米最佳发芽条件。

Ca2+浓度、发芽温度、发芽时间三个因素对黑米发芽过程中蛋白酶活力的影响见响应面曲面图6——8。

由图6——8可以看出：响应面存在极值；通过Design-Expert8.0.5b 软件分析可得，当 Ca2+浓度 0.51 mmol／L、发芽温度 22.62 ℃、发芽时间为 5.15 d 时，蛋白酶活力为 354.867 U。

考虑实际操作，对结果进行修正得到的黑米发芽最佳工艺条件为：Ca2+浓度 0.5 mmol／L、发芽温度 22℃、发芽时间5 d。验证试验表明，此工艺条件下的蛋白酶活力为 347.5 U。

图6 Ca2+浓度-发芽温度对黑米发芽过程中蛋白酶活力的影响Figure 6 Effect of Ca2+concentration and temperature on protease activity of black rice during germination

3 结论

通过单因素试验筛选出Ca2+浓度、发芽温度、发芽时间作为响应面试验因素，应用响应面分析3个因素对黑米发芽过程中蛋白酶活力的影响，确定影响顺序为发芽温度＞发芽时间＞Ca2+浓度。黑米发芽的最佳工艺条件为：Ca2+浓度 0.5 mmol／L、发芽温度 22 ℃、发芽时间5 d。在此工艺条件下，蛋白酶活力为347.5 U。

图7 Ca2+浓度-发芽时间对黑米发芽过程中蛋白酶活力的影响Figure 7 Effect of Ca2+concentration and germination time on protease activity of black rice during germination

图8 发芽温度-发芽时间对黑米发芽过程中蛋白酶活力的影响Figure 8 Germination temperature and time on protease activity of black rice during germination