，

随着我国生活水平的升高，而忽略了科学的生活习惯，是导致我国现阶段脑梗死发病率逐年升高的最主要的原因。脑梗死的高致残率严重影响了人类的生活质量，而以我国的形势最为严峻[1]。虽然溶栓治疗对部分急性脑梗死病人的康复有明显效果，但因有时效限制，且有诱发脑出血潜在危险，故无法惠及所有病人[2]，目前种类繁多的神经保护药物临床应用疗效欠佳[3]。因此脑梗死的有效治疗仍是现阶段研究的重点。

脑梗死发生后神经细胞因缺血导致损伤或凋亡，损伤的神经细胞膜通透性增加，炎性细胞聚集，有害的细胞因子表达升高，神经细胞自我修复能力下降[4]。神经干细胞(neural stem cells，NSCs)有强大的增殖能力，并能分化成为神经元和神经胶质细胞，且来源广泛[5]，Li 等[6]研究显示，神经干细胞移植可观察到脑梗死动物模型有新生的神经细胞。神经干细胞被认为是对神经系统疾病有确切疗效作用的最佳干细胞[7-8]。

人参川芎嗪注射液有效成分为人参、川芎嗪，两者联合可达到益气活血之疗效，有研究显示，人参川芎嗪注射液可以正面干预大鼠缺血性脑梗死[9]。本研究通过人参川芎嗪注射液联合神经干细胞移植对大鼠脑梗死模型的干预，检测NSCs的迁移情况，观察神经功能的变化，检测脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)基因以及BDNF蛋白的表达水平，来综合评价其治疗效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物 纯系成年清洁SD大鼠60只，2月～3月龄，体重170 g～220 g，孕14 d～16 d的SD大鼠2只，均购于河北医学科学院动物实验室，动物质量合格证号：SCXK(冀)20140009。饲养温度20 ℃～25 ℃，相对湿度(57±3)%，正常饲养，以动物伦理学标准在实验中对动物进行处置。

1.2 主要试剂及设备 人参川芎嗪注射液，天洋(安徽)药业生产；IMDM、BrdU、BrdU一抗、Brdu二抗，购自美国Bachem公司；Trizol试剂盒，购自Cytoskeleton公司；逆转录试剂盒、羊抗兔二抗，购自海泰克生物技术有限公司；引物序列，购自成都法玛基因科技有限公司；紫外透射仪，购自美国UVP公司；荧光显微镜，购自上海研润光机科技有限公司；PVDF膜，购自美国Santa cruz公司；ECL试剂盒，购自福建博特生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NSCs的分离培养 取孕14 d～16 d的SD大鼠1只，10 g/L巴比妥钠注射液以35 mg/kg的剂量进行腹腔注射，75%酒精浸泡10 min后经腹部切口切开显露子宫，剪开子宫将胎鼠取出，将胎鼠的大脑开颅暴露，精细剥除脑膜及血管组织，小心摘取胎鼠的端脑组织。将所得脑组织切碎成小颗粒并用200目筛网分散过滤，移入盛有标准培养液的细胞离心管内，轻轻吹打制成单细胞悬液，将浓度调整为1×106/mL，接种细胞至Corning培养瓶内，置入37 ℃，5%二氧化碳(CO2)设定的培养箱中悬浮培养，隔天更换1次培养液，2.5 g/L胰蛋白酶和0.02% EDTA混匀后将聚集的干细胞消化成单细胞，进行离心后更换为新鲜的培养液仍如上条件下培养。每4 d进行1次换液，每7 d传代1次，继续培养至12 d。于移植前1 d加入10 mg/L的Brdu至培养液进行标记，静置1 d后以IMDM洗涤3次，再进行消化、离心，以生理盐水将细胞悬液调配成1.6×108/mL，转至EP管中备用。应用免疫荧光法于荧光显微镜下对神经干细胞进行鉴定。

1.3.2 动物模型的建立 采用Zea Longa线栓法[10]制作急性脑梗死大鼠模型。6%水合氯醛腹腔注射(5 mL/kg)麻醉，将大鼠固定在操作台，取颈正中偏右切口分离大鼠的右颈总动脉，将颈内、外动脉分叉处游离，于远端结扎颈外动脉。颈总动脉分叉下方切一小口，迅速将0.2 mm的钝头尼龙线插入颈内动脉，进线至分叉处约2 cm感受到轻度阻力后固定尼龙线，保留1 h后拔出缝合血管并逐层关闭伤口。大鼠出现动脉闭塞对侧肢体运动障碍可认定造模成功。

1.3.3 实验分组 大鼠脑梗死模型制备成功术后第3天，将进入实验的大鼠随机分为NSCs移植组、联合组和模型组。将BrdU标记的神经干细胞浓度调整为1×105/L，NSCs移植组和联合组经尾静脉注射10 μL NSCs，模型组则注射10 μL生理盐水。各组动物于术后第6天开始，联合组经腹腔注射人参川芎嗪注射液以10 mg/kg剂量每日给药一次，连续给药15 d，NSCs移植组和模型组则以相同体积生理盐水经尾静脉注射。

1.3.4 免疫荧光法检测各组梗死区BrdU标记 NSCs的数目及迁移趋势 移植术后4周，采取免疫荧光检测方法[11]观测各组梗死区BrdU标记 NSCs 的数目及迁移情况。每组随机选取6只大鼠麻醉下处死，取大鼠梗死区脑组织制作5 μm切片，经脱蜡后放入梯度酒精中水化。PBS冲洗3次，置入2 mol/L的HCl中冰上孵育10 min，室温下继续孵育10 min，再于37 ℃下孵育20 min，放入硼酸中和。PBS冲洗后加入BrdU一抗(1∶50)，37 ℃避光孵育1 h后再放入4 ℃保温箱孵育过夜，经12 h后滴加荧光二抗，室温下避光1 h晾干，在高倍镜(×200)下于切片内满意视野中随机选取10个进行观测，对每个视野内的BrdU阳性细胞进行计数，所得数据取其均值。

1.3.5 通过BBB评分观察各组大鼠的神经行为学评分 3组大鼠均于移植及移植后的1周、2周、3周进行相关神经行为评定。以BBB评分(Basso，Beattie，and Bresnahan Locomotor Rating Scale，BBB Scale)[12]为观测标准，患侧后肢运动功能总分21分，患侧后肢全瘫为0分，功能完全正常者为21分，观测项目：关节活动范围、负重程度、运动协调性、肢体与尾部活动状态等。评分均固定于每日09：00于空旷安静的实验室内由2位非本项实验组专业人员进行。取两名人员评分的均值进行统计学分析。

1.3.6 逆转录PCR反应技术检测梗死组织BDNF基因的表达 依照参考文献[13]方法，移植后2周，应用Trizol试剂使用说明分别提取3组细胞总RNA，按照逆转录试剂盒操作步骤逆转录成cDNA。实验引物序列及产物长度见表1，实验重复操作3次，扩增反应条件如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性40 s；57 ℃退火5 s；72 ℃延伸55 s；72 ℃反应10 min；共36个循环。PCR所得产物经过1.2%琼脂糖凝胶电泳后，应用紫外透射仪进行观测并记录结果。用BDNF/GAPDH比值代表BDNF mRNA的相对表达量。

表1 引物序列

1.3.7 采用WesternBlot法检测梗死组织BDNF蛋白的表达 依据参照文献[14]步骤方法，取各组的梗死组织悬液经细胞裂解液反应后以离心半径16 cm，1 500 r/min离心15 min，取上清，每组分别取8.2 μg蛋白，以Bradford法进行总的蛋白浓度测量。5%浓缩胶40 V衡压1 h，10%分离胶恒压60 V，3.5 h，湿转14 V恒压14 h，37 ℃摇床封闭2 h，洗膜10 min，3次，兔抗鼠抗体BDNF于4 ℃ 过夜；抗鼠GAPDH(1∶1 000)4 ℃过夜。TBST 洗膜5 min×4次，山羊抗兔抗体1∶700，37 ℃摇床孵育1.5 h，TBST洗膜5 min×4次。再次运用TBS洗膜10 min后ECL显色 ，按Quantity one图像进行分析研究，BDNF与GAPDH的灰度积分的比值进行分析，作为BDNF蛋白表达的量。

2 结 果

2.1 NSCs的形态观察 细胞提纯前光镜下可见 NSCs呈球状，形态规则，悬浮生长，折光性较强，细胞球中细胞数目从数十个到数百个不等，接种24 h后，大部分细胞呈贴壁(见图1A)，3 d时可见哑铃形细胞分裂相(见图1B)，4 d时形成的神经干细胞球增多，大小不均一，形状不规则，7 d后可见悬浮的神经球，形状规则，呈球形，球体中间细胞密集，细胞界限不清(见图1C)。神经干细胞Nestin免疫荧光化学染色呈绿色球形。详见图1。

图1体外分离培养大鼠的NSCs(倒置显微镜，×200)

2.2 免疫荧光法检测各组梗死侧BrdU标记NSCs的数目及迁移趋势 免疫荧光法检测结果显示，BrdU荧光染色在镜下表现为红色，细胞呈神经元形态，BrdU 分布于胞浆及胞核。脑梗死组仅有少量的 BrdU 阳性细胞出现，而NSCs移植组有较多的 BrdU 阳性细胞出现(P<0.01)。与脑梗死组、NSCs移植组相比，联合组BrdU 阳性细胞表达量最多，差异有统计学意义(P<0.05)。各组BrdU标记 NSCs的数目比较见图2。从图2C中还可以看出，联合组BrdU标记的阳性细胞较脑梗死组及NSCs移植组更广泛地分布于病灶迁移的路径上。提示人参川芎嗪注射液干预更好地提高了脑梗死后NSCs 的增殖及迁移能力。

图2 BDNF蛋白的相对表达量(×200)

2.3 BBB神经功能评分结果 移植前各组大鼠的神经学功能评分差异无统计学意义，移植后1周、2周、3周，联合组的BBB神经行为学评分明显高于脑梗死组及NSCs移植组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

2.4 逆转录PCR检测BDNF基因表达结果 移植后2周，联合组BDNF mRNA表达水平明显高于脑梗死组及 NSCs移植组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3、图3。

组别nBDNFmRNA脑梗死组200．42±0．08NSCs移植组200．82±0．071)联合组201．75±0．091)2) 与脑梗死组同时间比较，1)P<0．05；与NSCs移植组同时间比较，2)P<0．05。

图3各组BDNF mRNA的相对表达量

2.5 Western Blot检测BDNF蛋白表达结果 联合组BDNF蛋白表达水平明显高于脑梗死组及NSCs移植组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表4、图4。

组别n BDNF蛋白脑梗死组200．43±0．01NSCs移植组200．82±0．051)联合组201．65±0．021)2) 与脑梗死组同时间比较，1)P<0．05；与NSCs移植组同时间比较，2)P<0．05。

图4各组BDNF蛋白表达

3 讨 论

脑梗死后神经细胞大量凋亡，多位学者认为梗死灶周围的“缺血半暗带”是关系到神经功能恢复程度的关键部位，故治疗重点应是尽量保存该区有活性的神经细胞数量[15-16]。长时间以来对神经细胞的认识是无再生性的，但近年不断对神经营养因子及干细胞的研究发现，神经细胞具有再生能力，对脑梗死后的神经恢复有明显促进作用[17-18]。

干细胞包括胚胎干细胞与成体干细胞，具备强大的自我增殖和分化潜能，是高度未分化细胞。胚胎干细胞包括神经干细胞和骨髓造血干细胞，而神经干细胞可以在一定时间内在靶区向神经系统多类细胞定向分化，并有明确的治疗效果[19]。研究发现，神经干细胞对免疫应答的反应非常微弱，可以有较多的存活细胞到达缺血半暗带区[20-21]。Mei等[22]研究显示，神经干细胞经过移植到缺血区脑组织，可以明确缩小脑梗死面积，实验大鼠的神经功能障碍有明显改善。Savitz等[23]将脑梗死后遗留神经功能缺陷的病人进行猪胎儿来源的干细胞移植，经移植术后数个月检测发现，部分病人的肢体活动及语言障碍有改善，影像学检查亦提示移植区出现了信号增强。

前人研究发现，经尾静脉注射神经干细胞至实验鼠后，神经干细胞可以定向迁移至脑梗死区[24-26]，其具体机制：急性脑梗死后的血脑屏障通透性增加，神经干细胞可以较轻易地穿过血脑屏障迁移至坏死病灶周围；细胞表面某些黏附因子诱导干细胞的定向迁移[26-27]。因此，本实验采用了经尾静脉注射干细胞的移植方法，而放弃了有创的定向移植手术，这样既简化了实验步骤，又可以减少因手术导致的炎性反应及穿刺出血致使移植失败的概率，对临床应用更有实际意义。

有实验表明，川芎嗪可以在一定程度上保护神经细胞[28]，其有效成分川芎可以有效透过血脑屏障，经过促血管内皮生长因子及成纤维细胞生长因子的刺激，可以对缺血性脑组织损伤的动物模型在干细胞移植后起到保护神经细胞和改善微循环的作用[29]。川芎嗪在体内有类似钙离子通道阻滞剂作用，川芎嗪以抑制细胞膜的钙离子通道形式，增加了细胞内的钙离子负荷超载障碍[30]。Fan等[31]的研究提示川芎嗪可以强化神经元细胞的抗氧化能力，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，清除神经细胞的氧自由基，从而减轻神经细胞的功能障碍。研究发现川芎嗪有诱导干细胞分化的作用，撒亚莲等[32]经过川芎嗪干预小鼠骨髓间充质干细胞移植后，干细胞逐步分化演变为神经元样结构，并且各细胞存在轴突间的连接。人参组分对缺血性脑血管病的影响已有较多研究，其作用机制可能是改善缺血区脑组织的血液循环，降低脑水肿严重程度[33-34]，改善血液流变学状态以及抑制血小板作用[35]。

为提高移植干细胞的存活率及向神经细胞的定向分化率，兼顾改善干细胞靶点的微环境，本实验采用了人参川芎嗪注射液联合NSCs移植的方法。脑源性神经营养因子可以促进神经细胞的增殖与分化[36]，促进神经元的代谢，并对神经细胞有保护作用[37]。通过观察大鼠神经功能的变化以及BDNF基因及蛋白的表达水平变化，评价人参川芎嗪注射液与NSCs移植联合干预大鼠急性脑梗死模型的疗效。本研究结果发现，联合组NSCs数目较单纯NSCs移植明显增多，神经功能各项指标以联合组表现最优，而NSCs移植组明显优于脑梗死组；BDNF基因及蛋白的表达水平，联合组明显高于脑梗死组及 NSCs移植组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示神经干细胞移植及人参川芎嗪注射液联合干预能够促进大鼠脑梗死后BDNF基因与蛋白的表达，并能明显改善脑梗死后大鼠神经功能的恢复。

综上所述，人参川芎嗪配合神经干细胞移植联合治疗大鼠脑梗死后模型，比单纯神经干细胞移植能从更多途径促使神经功能有效恢复。进一步探讨神经干细胞与人参川芎嗪等协同干预具体的作用机制，以及如何增加神经干细胞的存活率和定向分化程度，需要更多的实验研究丰富实验依据，为神经干细胞移植治疗脑梗死使神经功能有效恢复的临床应用提供实验基础。

[1] 李青.急性脑梗死与血浆同型半胱氨酸关系研究[J].中国医药导报，2011，8(1)：29-30.

[2] Hacke W，Donnan G，Fieschi C，et al.Association of outcome with early stroke treatment：pooled analysis of ATLANTIS，ECASS，and NINDS rt-PA stroke trials[J].Lancet，2004，363(9411)：768-774.

[3] Ehrenreich H，Weissenborn K，Prange H，et al.Recombinant human erythropoietin in the treatment of acute ischemic stroke[J].Stroke，2009，40(12)：e647-e656.

[4] Molina CA.Reperfusion therapies for acute ischemic stroke：current pharmacological and mechanical approaches[J].Stroke，2011，42(Suppl 1)：S16-S19.

[5] Azevedo-Pereira RL，Medei E，Mendez-Otero R，et al.Isolation of neurosphere-like bodies from an adult patient with refractory temporal lobe epilepsy[J].Arq Neuropsiquiatr，2010， 68(6)：956-958.

[6] Li Y，McIntosh K，Chen J，et al.Allogeneic bone marrow stromal cells promote glial-axonal remodeling without immunologic sensitization after stroke in rats[J].Exp Neurol，2006，198(2)：313-325.

[7] Hayashi J，Takagi Y，Fukuda H，et al.Primate embryonic stem cell-derived neuronal progenitors transplanted into ischemic brain[J].J Cereb Blood Flow Metab 2006，26(7)：906-914.

[8] Liu H，Honmou O，Harada K，Nakamura K，et al.Neuroprotection by PIGF gene-modified human mesenchymal stem cells after cerebral ischaemia[J].Brain，2006，129(Pt 10)：2734-2745.

[9] 韩辉，吴丽敏.人参川芎嗪注射液对局灶性脑缺血大鼠血清SOD活性、MDA含量及脑组织氨基酸含量的影响[J].成都中医药大学学报，2009，32(1)：76-78.

[10] Zea Longa E，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat[J].Stroke，1989，20：84-91.

[11] 敖然，吴美延.胚胎脑片免疫荧光组织化学双重漂染技术在神经元发生研究中的应用[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2011，20(1)：80-84.

[12] Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC，et al.Mascis evalua tion of open field locomotor scores：effects of experience and teamwork on reliability[J].Multicenter Animal SpinalCord Injury Study，1996，13(7)：343-359.

[13] Wang F，Zhang YC，Zhou H，et al.Evaluation of in vitro and in vivo osteogenic differentiation of nano-hydroxyapatite/chitosan/poly(lactide-co-glycolide) scaffolds with human umbilical cord mesenchymal stem cells[J].Journal of Biomedical Materials Research，2014，102(3)：760-768.

[14] 刘云云，赵兴绪， 赵红斌 ，等.川芎嗪体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究[J].生物学杂志， 2010，27(6)：21-24.

[15] Fisher M.The ischemic penumbra：a new opportunity for neuroprotection[J].Cerebrovasc Dis，2006，21(2)：64-70.

[16] Sallustio F，Diomedi M，Centonze D，et al.Saving the ischemic penumbra：potential role for statins and phosphodiesterase inhibitors[J].Curr Vasc Pharmacol，2007，5(4)：259-265.

[17] Li Y，Chen J，Chen XG，et al.Human marrow stromal cell therapy for troke in rat：neurotrophins and functional recovery[J].Neurology，2002，59(4)：514-523.

[18] Kim SS，Yoo SW，Park TS，et al.Neural induction with neurogenin1 increases the therapeutic effects of mesenchymal stem cells in the ischemic brain[J].Stem Cells，2008，26(9)：2217-2228.

[19] 臧大维，刘娟，左宪华.脑源性神经生长因子促进脑梗死后小鼠内源性神经干细胞的增殖及向神经元分化[J].中国临床康复，2006，10(33)：4-6.

[20] Zhang ZH，Wang RZ.Transplantation of neural stem cells modified by human neurotrophin-3 promotes functional recovery after transient focal cerebral ischemia in rats[J].Neurosci Lett，2008，444(3)：227-230.

[21] Andres RH，Horie N，Slikker W，et al.Human neural stem cells enhance structural plasticity and axonal transport in the ischaemic brain[J].Brain，2011，134(Pt 6)：1777-1789.

[22] Mei AN，Zhang SM，Xu F，et al.Proliferation and differentiation of endogenous neuronal stem cells in situ in the ischemic adult rat brain[J].Journal of Huazhong University of Science and Techology，2006，35(1)：30-36.

[23] Savitz SI，Dinsmore J，Wu J，et al.Neurotransplantation of fetal porcine cells in patients with basal ganglia infarcts：a preliminary safety and feasibility study[J].Cerebrovascular Diseases，2005，20(2)：101-107.

[24] Ke Y，Chi L，Xu R，et al.Early response of endogenous adult neural progenitor cells to acute spinal cord injury in mice[J].Stem Cells，2006，24(4)：1011-1019.

[25] Chu K，Kim M，Jeong SW，et al.Human neural stem cells can migrate，differentiate，and integrate after intravenous transplantation in adult rats with transient forebrain ischemia[J].Neurosci Lett，2003，343(2)：129-133.

[26] 杜志刚，伊红丽，王艳玲 ，等.人脂肪神经干细胞移植对大鼠脑缺血后血管新生和细胞因子的作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13(10)：1823-1828.

[27] Veeraraghavalu K，Choi SH，Zhang X，et al.Endogenous expression of FAD-linked PS1 impairs proliferation，neuronal differentiation and survival of adult hippocampal progenitors[J].Molecular Neurodegeneration，2013，8：41.

[28] 王桂双.丹参川芎嗪注射液对脑血栓患者神经功能的影响[J].中医临床研究，2015，25：64-65.

[29] 曲铁兵.川芎嗪预处理促进骨髓间充质干细胞迁移的体外研究[D].杭州：浙江中医药大学，2014：28-35.

[30] 纳鑫，汪雪兰，皮荣标.川芎嗪对中枢神经系统的药理作用及其机制的研究进展[J].中药新药与临床药理，2008，19(1)：77-80.

[31] Fan LH，Cheng KZ.Anti-apoptotic and neuroprotective effects of tetramethylpytazine following spinal cord ischemia in rabbits[J].BMC Neuroscience，2006，7：48-52.

[32] 撒亚莲，李海标.川芎嗪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究[J].解剖学报，2003，34(5)：514-517.

[33] 张英鸽，刘天培.人参总皂苷对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国药理学与毒理学杂志，1994，8(1)：12.

[34] 刘力，徐华丽，曲绍春，等.人参果皂苷注射液对大鼠实验性脑缺血的保护作用[J].中国老年学杂志，2006，9(26)：1242-1244.

[35] 徐彦君，陈正，刘杰，等.人参二醇组皂苷对血液流变性的影响[J].药学通报，1988，23(5)：284.

[36] 张勇，朱春然，陶轶.脑源性神经营养因子对胎鼠神经干细胞向神经元方向分化的诱导[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12 (51)：10073-10076.

[37] 罗媚，龙大宏，谷海刚，等.脑源性神经营养因子体外诱导神经干细胞向神经元分化[J].解剖学研究，2008，30(3)：190-192.