吴晓花，吴新义，汪 颖，汪宝根，鲁忠富，徐 沛，李国景

(浙江省农业科学院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

瓠瓜[Lagenariasiceraria(Mol.) Standl.] (2n=2x=22)，又名瓠子、扁蒲、葫芦、蒲瓜、长瓜等，属于葫芦科葫芦属，一年生草本植物。瓠瓜既可以嫩果作新鲜蔬菜，也可以成熟果实作容器。浙蒲1号、浙蒲6号、浙蒲8号、浙蒲9号是浙江省农业科学院蔬菜研究所育成的瓠瓜系列品种，它们以瓜形美观、鲜味浓、口味佳等诸多优点而广受市场欢迎。等位基因(位点)的差异是导致表型多样性的重要原因。通过检测不同品种中的基因型，可推测出其对应的表型特征。例如水稻的落粒性基因qSH1，具有与Kasalath一样的SNP位点的都是落粒品种，而具有与日本晴一样的SNP位点的都是不落粒品种[1]。大豆的有限和无限结荚习性由Dt1和Dt2位点的等位变异同时控制，Dt1表达越强的品种，无限结荚习性越突出[2]。在黄瓜中，Bt基因控制果实的苦味，不同品种中Bt上的SNP，决定了该品种有无苦味[3]。

瓠瓜瓜形的美观程度对消费者选购具有重要的直观影响，鲜味则在瓠瓜的风味构成中占突出地位。瓜形和鲜味均是复杂性状，由多基因控制。全基因组关联分析(genome-wide association study， GWAS) 是研究作物复杂性状遗传结构的有效手段[4-6]。在我们前期的研究中，曾利用GWAS的方法在瓠瓜基因组上鉴定出16个与鲜味氨基酸含量显著相关的SNPs和37个与瓜形显著相关的SNPs[7-8]。通过分析鲜味与游离氨基酸含量之间的关联性，认为游离谷氨酸含量是控制瓠瓜鲜味的一个主要因子，可以作为鉴定瓠瓜鲜味的间接度量指标[7]。本研究以浙蒲系列瓠瓜品种为材料，利用多重PCR+高通量测序的方法，检测了已知的16个鲜味相关SNPs和37个瓜形相关SNPs，通过数据处理、品种间SNP位点比较分析，旨在阐释遗传变异与性状之间的关系，从而揭示浙蒲系列瓠瓜品种优异外形与鲜味品质的基因型基础，促进更美观和美味瓠瓜新品种的培育。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为浙江省农业科学院蔬菜研究所选育的浙蒲系列瓠瓜品种，包括浙蒲1号、浙蒲6号、浙蒲8号、浙蒲9号以及其亲本YW、Y10、I180、NXZ、G7、G11、J63。浙蒲6号于2009年育成，浙蒲8号于2015年育成，浙蒲1号和浙蒲9号是目前表现优异，有望成为新品种的新组合。所有材料于2015年种植于海宁实验基地(30° N， 120° E)。采用人字架栽培，畦宽连沟1.6 m，双行种植，行距75 cm，株距40 cm，每份材料种植20株。

1.2 DNA提取

取各品种生长2周的幼嫩叶片，液氮研磨后用DNA提取试剂盒(TIANGEN Co. Ltd， Beijing)提取其基因组DNA，具体操作方法参见试剂盒使用说明。

1.3 鲜味的度量与测定

鲜味的度量与测定参照Wu等[7]的方法进行。每份材料采摘商品成熟期、瓜型一致的果实，每3个果实为一组，切取等质量的(50～70 g)果实制成匀浆后放于-80 ℃保存，每份材料做3份匀浆样品。游离氨基酸检测时，每份匀浆样品称取1.5 g，加入3%的水杨酸定容至8 mL， 室温下振荡1 h，15 000 r·min-1离心15 min，用一次性注射器抽取上清液，过滤后用日立L-8900氨基酸自动分析仪检测。

1.4 多重PCR

多重PCR反应总体积为50 μL，主要包括2x Multiplex Buffer 25 μL，混合引物5 μL， DNA 20 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共21个循环，最后72 ℃延伸10 min。2%琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，将目的片段使用TruSeq Nano DNA Library Preparation Kit，进行高通量测序文库构建。使用MPprimer程序设计多重PCR引物，用于分析的16个鲜味相关SNPs位点序列信息来自Wu等[7]，37个瓜形相关SNPs位点序列信息来自Xu等(数据待发表)。

1.5 PCR产物测序和SNP 赋值

使用Illumina HiSeq高通量测序平台测序，利用Illumina 分型软件CASAVA v1.8.2 (http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/casava.ilmn) 产生原始数据，用SeqPrep (https://github.com/jstjohn/SeqPrep) 去除接头和引物，用Sickle (https://github.com/najoshi/sickle) 修读以获得高质量净数据，然后用BWA (http://bio-bwa.sourceforge.net/) 软件与杭州长瓜的参考序列比对，用GATK “UnifiedGenotyper”功能检测SNPs。

2 结果与分析

2.1 浙蒲系列瓠瓜瓜形特征与鲜味品质

浙蒲1号、浙蒲6号、浙蒲8号、浙蒲9号果实均为棒形，上下粗细较均匀，其中浙蒲6号为典型的长棒形，浙蒲8号为中长棒形，浙蒲1号和浙蒲9号果实为短棒形，各品种及其亲本瓜形特征如图1所示。为了探索浙蒲系列瓠瓜的鲜味品质，我们测定了上述4个品种及其亲本的游离氨基酸含量，结果表明，浙蒲系列品种中浙蒲9号的游离谷氨酸含量最高，依次为浙蒲1号、浙蒲8号、浙蒲6号(表1)，各品种之间的游离谷氨酸含量差异达到显著水平(P<0.05)。浙蒲8号和浙蒲1号均有一个游离氨基酸含量较高的亲本，它们的另一亲本游离谷氨酸含量则一般，但杂交种鲜味表现较好。浙蒲9号的两个亲本游离谷氨酸含量均较高(表1)。

2.2 多重PCR扩增

根据已知的16个鲜味相关SNPs位点和37个瓜形相关SNPs位点序列信息，本研究共设计了53对引物(表2)。利用这些引物对浙蒲1号、浙蒲6号、浙蒲8号、浙蒲9号及其亲本进行多重PCR扩增，获得了各材料清晰的目标条带用于文库构建和测序(图2)。

图1 浙蒲系列瓠瓜及其亲本瓜形特征Fig.1 The fruit shapes of Zhepu bottle gourds and their parents

表1浙蒲系列瓠瓜品种游离谷氨酸及总氨基酸含量

Table1The free Glu content and total amino acid contents in Zhepu bottle gourds

μg·g-1

空心箭头表示目的条带；实心箭头表示为引物二聚体。The white arrow indicates target fragment， and the black arrow indicates the primer dimer.图2 多重PCR扩增电泳条带Fig.2 The electrophoresis strip of multiplex PCR

本研究根据测序总的Reads数，总测序碱基数，Q20，Q30比例以及GC含量等指标对各材料的测序数据质量进行了评价，其中Y10获得的Reads数最少，只有2 553 358，浙蒲1号生成的Reads数最多，达到4 100 725，11份材料的平均Reads数为3 323 728，最小的Q20值为95.80%，最小的Q30值为87.31%，每个样品的Map%从86.34%到88.24%不等，各材料测序的GC含量基本一致(表3)。

2.3 目标SNPs检测的覆盖度与特异性

数据分析、SNP位点比对表明，测序结果覆盖了所有的目标SNPs。在16个鲜味相关SNPs位点中，有多态的有3个，分别为Chr04_4620748、Chr04_17798671、Chr09_11575954(表4)；在37个瓜形相关SNPs位点中，有多态的有13个，分别为Chr01_10982689、Chr01_19313361、Chr01_19616760、Chr02 _16259548、Chr02_18854883、Chr05_23431366、Chr06_6104710、Chr06_6489176、Chr06_11492700、Chr06_24405893、Chr08_9459328、scaffold321_149232和scaffold321_72491(表4)。

2.4 鲜味优异性状-有利等位型一致性分析

在16个鲜味相关的SNPs位点上，有3个位点在4个品种和亲本间有多态，其中Chr04_4620748和Chr04_17798671在浙蒲1号及其亲本间有多态，Chr09_11575954在浙蒲9号及其亲本间有多态，其他13个位点在4个品种和所有亲本间无多态。根据Wu等[7]对16个SNPs位点等位变异对游离谷氨酸含量的效应分析，等位变异Chr04_4620748-T、Chr04_17798671-T、Chr09_11575954-A、Chr01_6938814-C、Chr05_15711773-A、Chr09_10617120-C、Scaffold136_549253-A对瓠瓜果实中游离谷氨酸含量具有增加的效应。根据我们测得的基因型，浙蒲6号和浙蒲8号均含有4个相同的导致游离谷氨酸含量增加的等位变异(Chr01_6938814-C、Chr05_15711773-A、Chr09_10617120-C、Scaffold136_549253-A)。浙蒲9号还含有来自亲本I180的增效等位变异Chr09_11575954-A，浙蒲1号还含有来自亲本YW的另外2个增效等位变异Chr04_4620748-T和Chr04_17798671-T。我们据此认为，上述位点的等位变异是上述浙蒲系列品种优良鲜味品质的主要来源(表4)。

2.5 瓜形优异性状-有利等位型一致性分析

在37个瓜形相关的SNPs位点上，有13个位点在4份材料和亲本间出现多态。在位点Chr01_10982689上，浙蒲6号的亲本G7基因型是C，NXZ基因型是T，浙蒲6号为杂合基因型，说明来自G7的等位变异对浙蒲6号的长棒瓜形有贡献作用(表4)。相同的分析表明，浙蒲1号含有1个瓜形位点的等位变异，浙蒲6号和浙蒲8号均含有11个瓜形位点的等位变异，浙蒲9号含有2个瓜形位点的等位变异(表4)，这些位点的等位变异均影响到上述4个品种的瓜形。

3 讨论

多重PCR技术是在同一反应体系中同时扩增多个目的片段的PCR技术，自1988年Chambercian等[8]提出这一概念以来，由于其高效率、低成本的特点，在植物生物学研究中被广泛应用。万映秀等[9]建立3个多重PCR体系并用于鉴定黄淮麦区主要品种品质的相关基因。谭君等[10]利用多重PCR鉴定玉米的不同品种。陈浩东等[11]利用多重PCR技术实现对杂交棉纯度的鉴定。本研究以浙蒲系列瓠瓜品种为材料，利用多重PCR的方法，检测了已知的16个鲜味相关SNPs和37个瓜形相关SNPs，目标SNPs检测的覆盖度为100%，除目标SNPs以外，我们还检测出了504个非目标SNPs位点，但是这些并不影响我们对目标SNPs的分析，试验结果进一步说明多重PCR 技术已成为植物生物学研究中重要且成熟的研究手段之一。通过对影响鲜味的SNP位点等位变异的效应分析，我们发现浙蒲1号含有6个增加游离谷氨酸含量的等位变异，浙蒲9号含有5个增加游离谷氨酸含量的等位变异，浙蒲6号和浙蒲8号含有4个增加游离谷氨酸含量的等位变异。基于瓠瓜鲜味与游离氨基酸含量的相关性，我们认为上述鲜味SNPs的增效等位变异对4个品种的鲜味形成有贡献。由于鲜味的复杂性，除游离谷氨酸外其他化学物质可能也对瓠瓜鲜味形成有影响，因此除我们检测的SNP等位变异外，其他尚未检测到的位点也有可能影响这些品种的鲜味品质。

表2多重PCR所用的引物

Table2List of primer pairs used in multiplex PCR

染色体Chr.位置Position前引物Forwardprimer后引物Reverseprimersscaffold36421179GGAAAATCCTCAAGTAACAAGTCTTTCTCACAGATTTGAGGCCTATAAAAGGTGAGscaffold31335917ACCTGGTAGGCCTCAGTAGAACCGACGTTCTAATTTCTTAGGATTTTG-CAscaffold39072491CCATTTTCACAAACACTTTCAATCACTGGACATTGATTTCTTCCTCACAGCTAACscaffold350114296CTCTTCACAAATTGCTCGTAACAATAGCGCTTATCACTTTGGAGATTTGTCCGAscaffold3131187ATGATCAGGCTCTCCAAGGAGAAAAAATACAATACCGAGGAAGTCGAGTscaffold321149232GTTGAAATTTGCTTCAACCTTCTTAATGTCCAATTAGGTATCTCAATGGAAGGACT-GAChr02162191CCCACACCGAAAATTGTTTGTCGTCCTAAAGTAGGTGTGGAGTTGGTscaffold136549253CATTGCTCGCCATACCAGAAACTGAGGGAGAGATTGAAAAGATTGAG-GAChr031521867CCAATGACATTAAGTGCTGCAATCAGCCTAATCACAATCAAACTGCAACATGChr092837521ATGTTAGATGAAGAACAAAAGGAAGAAGGCTAACATCAACTACATGTAAAAG-TACCChr082878651GCCAATAATGAGTTCCAGGTGAGTCTTGTTGAACATCCATAGGCTTTTCAGChr044620748GCCTCTTTCATGGCTTGGGAATGGACTAAAATTCCTTTCGTTTGCGTChr104689037TTGCCCTGTTCATTTTGATGTCTAATGGATATTAGAAGTGTAGGTGTCCCA-CATTChr105448266TTTTCAATAGCTTTGCCAATCCAAAATCACATCACAAAAACATTGTTCGACTAT-TCChr095490094CCCAAAATTCAAGAAACAGATCTTAGAGAGGACAGGTGACCATTTTTCATTA-AGACTChr066104710CTTTGCTGGAGCAGATTTCACACAGTAAGGTTTGCGCTTAATTCAT-TCTTTTChr066301522GCTGAGGATCCGAATGCTGTTACGGCTGGTCTGATCCAAATTAACAChr066489176GATGCAACCCATTGTAAGAAAATGTAAGAAAAAATTAATTGGTTATCAGACG-GCTCTChr066828063TTGCATGGTGTTTCAATTACACATGTAAACTGCGAGTATGGTAGTGATAGTGCChr076884662GGCCATGGACACGGTAAAAATTATGGAATTAGGCAAAGCAGAAGAATTCACAChr016938814AGCAGCTGACCGTCATCTTAACCAAGGTTAAAACGGTAATTTGACCCAChr019104188CTACTTCTACCTATGGGTTTCCTTGTTTATCCCACCTAGTTGAGATTTCCTCT-TATChr059266893TCTTTGATACCAGTAGCGAGGTGATAGTTCACACAAAAATAGGGTATTGAC-TAChr089459328GCACCCACAAACACACTAAGAAATGACCATGCATTAACTTAGGCATTGGAChr0810100436CAGTATTGGCTAGTCTCATGAATCATCACCCACTCTCTCATTGACTTGAGAGTChr0910617120CTGCTTGATGAGACTTACATTTAACTAGGCCCTTCTCTAGCCAGTGAGAGAChr0910672327TTTAAACAAAGTTACAGTTCGCAACAAGTCCACAAACTGATCTAGGTATTCGT-GAAAChr0110729456CATAAATGGATCGATTCAGCTTGAAAACTGTACAAACATTTAAAGCTCGACTTG-TAGChr0110982689TCAGGTCTCGTTTGATGTCAGTGCCATCTAGATGAGGATGTAGTTGACGAChr0611492700TGTCATGGAAACAAAGCCTTGTTATAAGAGCTGATGAATTCTTAGGAAACTTTT-GCCChr0911563939GGCCCAAGTTTCCGACTCAATAGTCCAACCATAAACTAAGTCCCGATChr0911575954TTTAAGAGAACGGATTCTCAGGAAAAGACTCTGATGGGTTGTACATCTGCATChr0511924571CCAGGGACCGCATAGTTTTGAACGTCTCTCTCTTCCAATTCTGCTTTGChr0911955078CTCCTGTTTCTTCGGGATTATCCTTATGCCTCGAATGAATAATTGGTTTGT-GATCCChr0112052259ACCAGCTTGCAAGTCAGCTAAACCAAATGCGGTGTCTACACCTTChr0612227669CGGTGACTGCAGAACAAGACTTTGAATGGTCAATGGAACAAACT-GTTTTGChr0513270218TACCCTTACTTACATGTCTCCTCATGAAACAGCGATTCCTAAATAATTAAAT-GAGGChr0213566931GAAACTTTTAGCCACGTTCACTTGTCTTCAGAAAAGCGTGGGCAAATChr0213570856AGTTCGTGTATCTTGTAAGGATCAAATCCATTTGTCTAAGGAACAGTATCCTA-AGATChr0514197095TCTCCAATATCAATTGTCGATGATTGCTGGTTGGTTGATTATGTGCATAATGT-CATChr1114707964ACTTTGCAATCGTTACAAACGATGTCCCAAAATGACAGGCTAATTGAGTCChr0515711773TAGGATGATCATAGGTGACTTGACCTTTCCTCATTGTTCAAGACCTGGCATTAChr0216172329TTTTTGGAGACAGATTCAGAATATTCTGTGATCTTGATCATCAAGGTAAATTC-CTCTChr0216259548GATACTTGTTGGACGGTCCCTTTTCTATGATCATCGAGCCATCATATCA-GAChr0417798671TGTTACATTTGGTTGGCCTCCTTTTCACTATTGCCATAGCTGAGAATTCAGChr0218854883GAACTCTTGCATGACTTTTATCCCAATTCCGCTCTGAAGATTCACCAGGAAAAATChr0119313361AGAGGTGTTGACCGAAATGTGTGCCAACTTATCTTTAGGTTGAAACTT-GGChr0119616760AATCATAATTACCTTGAGGTGAAAGCGAGAAGCCATGTGGCAGAATTTGGChr1020175179ACGTGGATGTTTGTCATTAATTTGCCTTCCCAACCAAAAGGTTTCAAATGAT-TAChr0220541964TACCTCCTTAAGCATCACTAATCCCTTGCTTGTGAGGGCAATACTTTGATTChr0523431366TCGGGAATGTTCTGATTGCAGTTCTTTGAAAGGATTTACAAG-GAGTTTCAChr0624405893TGAAAATATAGAAAAGAAGGCAGTGATGTTTTTCGCATTTCTTATCTTCTACGGTTChr0536980374CCATGGGAGTGAAGATTCCAACAGGCTGATGATATTCCCAGTAATCA-CATT

表3多重PCR测序

Table3Sequencing data statistics of multiple PCR products

样品总Reads总碱基数Q20/%Q30/%GC/%对应Reads数对应率SampleTotalReadsTotalbasesMappedReadsMappedrate/%浙蒲1号ZhepuNo.1410072557525112996.1687.9441.6932919740.879浙蒲6号ZhepuNo.6341212147497729995.8587.5141.2526049550.863浙蒲8号ZhepuNo.8319666444309801695.8187.4941.5924254270.878浙蒲9号ZhepuNo.9307581643155653195.9487.5241.6524647720.882I180384880953452008895.8187.541.6828660930.869G11348482449026158596.3388.3141.3528036840.874G7351996849206290595.8287.3441.6827102050.878NXZ341023747863019296.1087.8041.6027179330.875Y10255335836081462295.9787.4441.7320401660.869YW306272442760950995.8087.3141.6723489710.867J63289576540752272296.0387.5641.6223183580.875

表4不同品种及亲本中鲜味和瓜形贡献SNP分布情况

Table4Distribution of umami taste and fruit shape related SNPs in various cultivars and their parents

项目ItemCHRPOSSNP浙蒲1号ZhepuNo.1浙蒲6号ZhepuNo.6浙蒲8号ZhepuNo.8浙蒲9号ZhepuNo.9I180G11G7NXZY10YWJ63增效等位变异SAV1)增效值Synergis-ticvalue鲜味UmamiChr044620748C/TYCCCCCCCCTCT69.13tasteChr0417798671C/TYCCCCCCCCTCT136.88Chr0911575954G/AGGGRAGGGGGGA80.4Chr016938814C/TCCCCCCCCCCCC36.77Chr0515711773A/GAAAAAAAAAAAA25.84Chr0910617120C/ACCCCCCCCCCCC47.01scaffold136549253A/GAAAAAAAAAAAA48.65瓜形FruitChr0110982689C/TCYYYCTCTCCTshapeChr0119313361A/GRAARGAAAAGAChr0119616760A/CCMMCCCACCCCChr0216259548T/CTTTTTTTCTTTChr0218854883A/CCMMCCCACCCCChr0523431366C/TTYYTTTCTTTTChr066104710A/TTWWTTTATTTTChr066489176G/TTGKTTGGTTTTChr0611492700A/TTWWTTTATTTTChr0624405893G/AARRAAAGAAAAChr089459328A/CCMMCCCACCCCscaffold321149232A/GGRRGGGAGGGGscaffold39072491A/GGRRGGGAGGGG

1) SAV， Synergistic allele variation.

通过瓜形优异性状和有利等位型的一致性分析，我们发现短棒品种浙蒲1号和浙蒲9号只含有1～2个影响瓜长的位点变异，而中长棒品种浙蒲6号和浙蒲8号则含有11个影响瓜长的等位变异，品种携带的瓜长位点等位变异数目与其瓜形长度呈正相关，说明这些位点对4个品种的瓜形有重要的贡献。在Chr02_16259548上，亲本之间存在多态，杂交个体却是非杂合的基因型，说明此SNP位点可能是一个假阳性位点。对于其他的没有多态性的瓜形相关SNPs位点，亲本和杂交品种都是纯合且一致的，说明这些位点可能在这些材料的瓜形上不贡献或者同时贡献。本研究以浙蒲系列瓠瓜品种为材料，利用多重PCR的方法，检测了已知的16个鲜味相关SNPs和37个瓜形相关SNPs，鉴定出浙蒲1号、浙蒲6号、浙蒲8号、浙蒲9号中可能对其鲜味品质和优美瓜形形成有突出贡献的有利等位变异，初步揭示了浙蒲系列瓠瓜品种优异外形与鲜味品质的基因型基础，为未来瓠瓜优美瓜形和鲜味品质分子育种工作奠定了基础。

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