尤 鑫 赵向寨 杨 雪 温彦静

1．天津市中心妇产科医院( 300100) ;2．河北医科大学第三医院;3．河北省中医院

宫颈鳞癌是女性［1］发展隐蔽，确诊时已不同程度的浸润、转移，寻找宫颈鳞癌的早期诊断指标尤为重要。宫颈鳞癌的浸润、转移涉及多种基因的调控，肿瘤细胞之间以及与基质间的黏附力改变、肿瘤细胞的迁移与增生能力以及血管的形成等。其发生主要因素是细胞间黏附力的变化及癌细胞与细胞外基质和基底膜的相互作用［2-3］。所以，细胞黏附分子在肿瘤细胞的浸润、转移中发挥了重要作用。整合素α2β1 作为黏附分子，主要通过调节细胞黏附和迁移而提高肿瘤的转移能力。黏附分子CD44V3，也能介导细胞与细胞之间及细胞与细胞外基质的黏附，促进肿瘤细胞浸润、转移及扩散［4］。整合素α2β1、CD44V3 在肿瘤的发生、发展，尤其是浸润与转移的过程中起着重要的作用。本研究探讨宫颈鳞癌组织和宫颈非癌组织中上述指标蛋白表达差异在宫颈鳞癌发生、发展中的作用。同时，采用逆转录-聚合酶链反应( RT-PCR) 技术检测两者在组织中mRNA 的表达，从基因水平探讨其与宫颈鳞癌发生发展关系。

1 资料与方法

1．1 基本资料

收集2015 年1 月—2017 年1 月间本院病例标本72 例，其中确诊［5］为宫颈鳞癌标本36 例( 宫颈鳞癌组) ，年龄( 55．4±6．8) 岁( 34～68 岁) ;角化型16例，非角化性型20 例;PTNM 分期I ～II 期19 例，III～IV 期17 例;淋巴转移25 例，无淋巴转移11 例;浸润深度T1～T216 例，T3～T4 20 例;患者术前均未接受放化疗。同期子宫平滑肌瘤手术切除的良性病变宫颈黏膜组织标本36 例( 对照组) ，年龄( 56．0±5．7) 岁( 32～73 岁) ，所有临床资料完整，两组年龄比较无差异( t=0．418，P=0．677) 。本研究得到本院伦理委员会的批准。

1．2 实验方法

1．2．1 标本处理 手术切除组织标本后，部分标本10%中性福尔马林溶液固定，逐级脱水、透明、常规石蜡包埋，连续切片，用于免疫组化SP 法染色实验;另一部分标本立即储存于-80℃冰柜中，用于提取RNA，行RT-PCR。

1．2．2 RT-PCR 检测 检测两组标本中整合素α2β1 mRNA、CD44V3 mRNA 的表达。组织标本立刻置于-80℃冰柜备用，提取总RNA，通过反转录及基因扩增合成整合素α2β1 和CD44V3 基因片段，琼脂糖凝胶电泳，并经成像系统采图，用Quantity One 软件分析其相对表达量。

1．2．3 检测结果分析 使用β?actin 作内参照，将扩增产物用1．5%琼脂糖凝胶电泳，通过成像系统Quantity One 采图后进行相对表达量分析。

1．3 阳性表达判定［6-7］

整合素α2β1 和CD44V3 的阳性水平采用阳性细胞数评分及染色强度评分综合判定。阳性细胞数评分:×200 倍显微镜下，随机4 个视野( 每个肿瘤细胞计数100 个) ，染色并统计阳性细胞记分，阳性细胞率＜10%为0 分，10%～25%为2 分，26%～50%为2 分，＞50%为3 分;染色强度评分，与背景色一致为0 分( 阴性) ，略深于背景色为1 分，中等黄色为2分，呈棕黄色或棕褐色( 且细胞浆也着色) 为3 分。综合判定:0 分为( -) ，1～2 分为( +) ，3 ～4 分为( ++) ，5～6 分为( +++) 。

1．4 统计学分析

使用SPSS19．0 统计软件进行数据分析，蛋白水平计算率，组间比较采用检验; 基因水平计算均数±标准差，组间比较使用t 检验; 整合素α2β1 和CD44V3 相关性采用Spearman 分析。P＜0．05 为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 宫颈鳞癌组整合素α2β1 和CD44V3 的表达

电泳图中可见在198bp 和100bp 处有特异性反应条带，分别是整合素α2β1 和β?actin 的电泳片段，以整合素α2β1 和β?actin 的灰度扫描值的比值作为整合素α2β1 mRNA 的表达值( 图1) ; 电泳图中可见在353bp 和100bp 处有特异性反应条带，分别是整合素CD44V3 和β?actin 的电泳片段，以整合素CD44V3 和β?actin 的灰度扫描值的比值作为整合素CD44V3mRNA 的表达值( 图2) 。

2．2 两组整合素α2β1mRNA 和CD44V3 mRNA 的表达

整合素α2β1mRNA、CD44V3mRNA 的表达值对照组( 0．09±0．03、0．13±0．02) 均低于宫颈鳞癌组( 0．52±0．08、0．65±0．11) ( P＜0．05) 。见图3。

2．3 两组整合素α2β1 和CD44V3 的表达

整合素α2β1 和CD44V3 在宫颈鳞癌组织中阳性率均高于对照组( P＜0．05) 。见表1。

图1 α2β1 mRNA 在宫颈鳞癌中的表达

图2 CD44V3mRNA 在宫颈鳞癌中的表达

图3 两组整合素α2β1mRNA 和CD44V3 mRNA 的表达情况比较

表1 整合素α2β1 和CD44V3 在两组中的表达(例)

2．4 宫颈鳞癌组整合素α2β1 和CD44V3 与临床资料关系

整合素α2β1 和CD44V3 的阳性表达与宫颈鳞癌患者的年龄无相关性( P＞0．05) ，但与患者的PTNM 分期、分化程度、是否淋巴结转移及浸润深度存在相关性( P 均＜0．05) 。见表2。

2．5 整合素α2β1 与CD44V3 在宫颈鳞癌组织中表达的相关性分析

整合素α2β1 和CD44V3 在宫颈鳞癌组织中的表达呈正相关性( r=0．369，P＜0．05) 。见表3。

表2 宫颈鳞癌组临床指标与整合素α2β1 和CD44V3 关系比较

表3 整合素α2β1 与CD44V3 在宫颈鳞癌组织中表达的相关性(例)

3 讨论

宫颈癌为全球妇女第二大恶性疾病，其发病率和死亡率呈递增趋势［8］。目前临床90%就诊宫颈癌患者均处于进展期，即确诊时已发生不同程度的局部浸润、转移［9］。所以寻找宫颈癌的早期诊断指标和特异性作用途径抑制转移或复发，将可能有效阻止并控制肿瘤的侵袭和转移［10］。宫颈鳞癌的浸润、转移是一个多因素、多阶段、复杂性的连续发展过程，最终结局是形成转移瘤［11］。

整合素α2β1 主要是细胞与I 型胶原蛋白作用的功能性受体，α2 亚基与基质成分特异性黏附，β1亚基通过其细胞内片段与细胞骨架连接，参与细胞信号的传导，调节细胞与胶原蛋白相互作用及肿瘤细胞浸润、转移过程中的各个基本环节［12］。通过识别与细胞外基质配体上特殊氨基酸结合，介导细胞与细胞、细胞与ECM 间黏附，导致肿瘤与周围组织黏附;通过黏附作用以及信号传导作用，参与炎症的反应、创伤的愈合、肿瘤的发生与转移、血栓的形成、免疫应答等生理病理过程。既往研究已表明，整合素α2β1 的黏附作用对维持组织完整和促进细胞迁移等重要作用［13］。整合素α2β1 的信号传导作用具有双向性，从而影响基因的表达，细胞的增殖、分化、凋亡等生物学行为。本研究观察到，宫颈鳞癌组整合素α2β1mRNA 的表达值、阳性率均高于对照组。与相关研究报道，在肿瘤组织及非肿瘤组织中，整合素α2β1 的表达水平存在差异，在胃癌的患者中整合素α2β1、α5 及α6 均呈持续高表达水平一致［14］。

CD44 广泛存在于细胞表面的一种跨膜糖蛋白，在细胞恶性转化过程中，其结构和功能均发生显著变化而影响转化后肿瘤细胞侵袭转移行为的粘附分子，在体内分布极广泛，能与透明质酸等多种配体结合，参与细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的粘附。CD44V 包括CD44V1 ～CD44V10，其中与肿瘤浸润、转移较为密切相关的是CD44V3、CD44V6 及CD44V9。CD44V3 能与透明质酸和细胞外基质成分等结合，参与细胞-细胞、细胞-外基质间的粘附过程［15］。刘晖等［16］发现CD44V3 基因蛋白在早期宫颈鳞癌的表达明显高于良性病变，在正常宫颈组织中未见表达，说明了CD44V3 在早期宫颈鳞癌发生发展中起着重要作用，与宫颈鳞癌的浸润深度、淋巴结转移及转移灶有显著相关性。Amaral 等［17］研究了黏附因子CD44V3 在正常绒毛、葡萄胎及绒癌中的表达及相关性，结果显示CD44V3 的过表达促进了葡萄胎、绒癌的浸润和转移，作为葡萄胎、绒癌浸润、转移及评价预后的生物学指标。

本研究发现，宫颈鳞癌组的CD44V3mRNA 的表达值、阳性率均高于对照组。康颖竹、Martins等［18-19］研究原发胃癌组织发现，CD44v3 的表达与胃癌的临床分级有关。鉴于此，我们进一步分析了整合素α2β1 和CD44V3 与宫颈鳞癌临床资料的关系，结果发现，整合素α2β1 和CD44V3 的阳性表达与宫颈鳞癌患者的年龄无明显相关性，但与宫颈鳞癌患者的PTNM 分期、分化程度、是否淋巴结转移及浸润深度均存在明显相关性; 整合素α2β1 与CD44V3 之间阳性表达率相关性分析显示，整合素α2β1 和CD44V3 在宫颈鳞癌组织中的表达呈正相关性。表明肿瘤细胞中整合素α2β1 及CD44v3 的高表达与肿瘤的恶化程度有关，与宫颈鳞癌的生物学行为有关。本研究也存在一定局限性，样本例数较少，且仅为单中心研究，但结果可为以后大样本多中心研究提供参考。

综上所述，整合素α2β1 和CD44V3 在宫颈鳞癌组织中呈高表达水平，且其与患者的PTNM 分期、分化程度、是否淋巴结转移及浸润深度密切相关，整合素α2β1 和CD44V3 联合检测可为宫颈鳞癌患者的诊治及预后评估提供参考。