樊秀敏

（辽宁省朝阳市建平县畜产品安全监察所，辽宁 朝阳 122400）

金刚烷胺为禁止用于兽用的抗病毒药品。金刚烷胺具有神经毒性，能使中枢神经系统受刺激或中毒，在食品中残留，对心肺及肾功能不全者，还容易导致蓄积毒性。

1 酶联免疫试剂盒准备

金刚烷胺酶联免疫试剂盒（Ⅳ型）。北京维德维康生物技术有限公司生产。

2 原理

鸡肉中的金刚烷胺与酶标板上固定的金刚烷胺特异性竞争抗体，当鸡肉中不含金刚烷胺或金刚烷胺含量很少时，更多的抗体就会与酶标板上的金刚烷胺结合，结合物被固定在酶标板上，加入酶标记物以后，底物被催化显色，根据显色的深浅来判断鸡肉中金刚烷胺的含量。显色越深，含量越少，显色越浅，含量越多。

3 工作液准备

3.1 样品提取液 1份浓缩样品提取液加19份去离子水。

3.2 样品稀释液 1份浓缩样品稀释液加9份去离子水。

3.3 洗涤工作液 1份浓缩洗涤液加19份去离子水。

3.4 酶标记物工作液 1份酶标记物浓缩液加10份酶标记物稀释液。

4 鸡肉前处理

4.1 称取2±0.05g均质后的鸡肉于50mL离心管中。

4.2 加入4mL样品提取液充分涡动5min。

4.3 离心机4000g以上，离心5min。

4.4 取0.2mL上清液于干净离心管中，加入0.2mL样品稀释液充分涡动10s。

4.5 取50μL进行检测。

5 检测

5.1 根据样品数量的多少取出相应数量的酶标板条固定在酶标板架上，要求做两个平行样，标记清楚标准品和样品的滴加位置。未使用的酶标板条用自封袋密封后，立即保存期于2～8℃环境中。

5.2 将 50μL 各标准品工作液（0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ppb）和50μL各样品溶液分别加入对应的酶标板孔中。

5.3 各孔均加入50μL酶标记物工作液，枪头不能接触到酶标板孔中的液体。

5.4 把酶标板用盖板膜盖好，轻轻振荡酶标板10s，使溶液充分混匀，在室温（25±2℃）下避光反应30min。

5.5 揭开盖板膜，把酶标板孔中的液体倒净，在每个孔中分别加入260μL洗涤工作液，充分洗涤4次，每次浸泡10～20s。

5.6 洗涤完毕后，倒掉酶标板孔中洗涤工作液，将酶标板倒倒置于吸水纸上，轻轻拍打到拍干。（用干净的枪头戳破孔底的气泡，为防止交叉污染戳气泡时要更换枪头）

5.7 立即在每个孔中分别加入100μL底物A、B的混合液（底物A、B按1：1比例混合，混合液使用不能超过5min）。

5.8 把酶标板用盖板膜盖好，轻轻振荡酶标板10s，使溶液充分混匀，在室温（25±2℃）下避光反应10min。

5.9 揭开盖板膜，各孔中分别加入50μL终止液，轻轻振荡酶标板10s，使溶液充分混匀。

5.1 0 加入终止液5min内，用酶标仪在双波长450nm、630 nm下读取酶标板吸光度值。

6 注意事项

6.1 试剂盒贮存于2～8℃环境中，切勿冷冻。

6.2 使用试剂盒前，应仔细阅读说明书。

6.3 请勿使用过期试剂盒，不同批号试剂盒中的试剂不能混用。

6.4 使用试剂盒前，将盒内各组份放在实验台上恢复至室温25±2℃。

6.5 样品处理前先恢复至室温，处理完毕后应立即检测。

6.6 避免使用金属类物质盛装和搅拌试剂。

6.7 各试剂在使用前应摇匀，混合时避免出现气泡。

6.8 酶标板孔中加入样品溶液、酶标记物工作液、AB混合液、终止液各步骤时间不得超过3min。

6.9 终止液中含有强酸物质，若不小心溅到皮肤或衣物上请立即用水冲洗。

6.1 0 检测过程中所用枪头不得重复使用。

做酶联免疫检测实验是一项认真谨慎的工作，把握好每一个环节都显得尤为重要，只有严格按照操作要求去做，才能保证检测结果的准确性，同时对监控违禁药品的使用也具有重要意义。