3种稀释液对鸡精液体外常温保存的影响

2013-09-23陶金忠石永宏单海涛

中国兽医杂志 2013年4期

陶金忠，石永宏，姜峰，单海涛，王冀

（1．宁夏大学农学院，宁夏银川750021；2．宁夏九三零生态农牧公司，宁夏银川750021）

为了长时间的保存精液且能够扩大精液的剂量，在精液中加入稀释液，其目的是为了保护精子有一个适合的存活环境，它需要维持适合的渗透压和电解质平衡，保证精子细胞膜的完整不受到伤害，维持精清的环境，能够给精子营养，提高其耐受温性、抗冻性、精子的活力和顶体完整，降低精子畸形率［1］。因此在稀释液中常加入一些保护剂成分。稀释液中保护剂常用的保护剂有糖类、卵黄、抗冻剂、非电解质、抑菌物质和抗氧化物质等［2］。

目前进行精液常温稀释保存的相关研究较少，也没有适合常温保存的鸡精液稀释液的配方。为了使精子在体外保存更长的时间。故拟在精液稀释液中添加稀释液，并通过本试验选择最佳的稀释液，以提高鸡精子的保存时间和利用率。

1 材料与方法

1．1 材料、药品和仪器材料：选择宁夏九三零生态农牧公司30只健康公鸡，分为3组，每组10只，采用按摩法采集新鲜精液，立即用3种稀释液稀释。药品与仪器：柠檬酸，Tris，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，猪精液稀释液，相差显微镜，电子称，量筒等。

1．2 试验方法

1．2．1 配制稀释液 3种稀释液配制：柠檬酸－Tris稀释液：果糖1g，柠檬酸1．4g，Tris碱2．42 g，配置100mL；磷酸盐稀释液：果糖3．6g，磷酸氢二钠0．212 2g，磷酸二氢钠0．3g，配置100mL；猪精液稀释液：德国猪精液稀释粉5g，配置100mL。并且在3种稀释液中均加入少许青霉素。

1．2．2 精液稀释采集的精液应用配制好的3种稀释液进行2倍稀释，混匀，注意保温，避免震荡、光照。置于17℃条件下，间隔不同时间观察精子活力、精子畸形数以及顶体完整数。并记录精子的存活时间，计算出存活指数。

1．2．3 精子形态和畸形率的测定及精子顶体染色观察准备洁净的载玻片进行涂片，风干后用中性福尔马林固定液15min，水洗晾干用Giemsa染液扣染2h，水洗晾干。

1．2．4 活力检测在温度37℃、400倍显微镜下观察直线运动的精子。精子的活力＝直线运动的精子／总精子个数×100%。

1．2．5 畸形率测定将准备好的抹片在显微镜下观察，每个抹片观察200个精子。畸形包括头部畸形、颈部畸形、尾部畸形。精子畸形率%＝畸形精子数／精子总数×100%。

1．2．6 顶体完整率测定将准备好的抹片在显微镜下观察，每个抹片观察200个精子。精子顶体不完整情况分为：顶体膨胀、部分脱落、完全脱落、头部畸形。精子顶体完整率%＝顶体完整的精子数／精子总数×100%。

1．2．7 存活时间测定将精液置于室温（17℃）下保存，设定不同时间间隔定时滴片镜检。精子的存活时间（h）＝检查间隔时间的总和减去最末两次检查间隔时间的一半。

1．2．8 存活指数测定精子的存活指数＝每前后相邻两次检查精子活力的平均数与间隔时间乘积的总和。

1．3 统计分析用SPSS11．0软件进行数据处理。

2 结果与分析

2．1 3种稀释液对精子活力的影响见表1。

从表1可以看出，添加磷酸盐稀释液的精子存活时间最长。从活力来看，在15h时，保存精液活力达50%的磷酸盐缓冲液和柠檬酸－Tris效果相当，但猪精液稀释液保存精子活力最差，与其他两个相比，差异显著。

2．2 3种稀释液对精子的畸形率的影响见表2。

通过试验和试验数据表明，相比之下，在3种稀释液中，添加磷酸盐稀释液的精子畸形率最低，添加猪精液稀释液的精子畸形率较高，添加柠檬酸－Tris稀释液的精子畸形率最高，但差异不显著。

表1 3种稀释液对精子活力（%）的影响

表2 3种稀释液对精子的畸形率的影响

2．3 3种稀释液对精子的顶体完整率的影响见表3。

表3 3种稀释液对精子的顶体完整率的影响

从表3可以看出，3种稀释液对鸡精液常温保存顶体完整率没有显著性影响，但猪精液稀释液稀释时顶体完整率较低，为91．61%±0．50%。添加柠檬酸－Tris稀释液的精子顶体完整率最高为94．19%±0．41%。

2．4 3种稀释液对精子的存活时间的影响见表4。

表4 3种稀释液对精子的存活时间的影响

从表4的3种稀释液对鸡精液常温保存存活时间影响来看，添加磷酸盐稀释液的精子存活时间最长，显著的高于其他两组。

2．5 3种稀释液对精子的存活指数的影响见表5。

表5 3种稀释液对精子的存活指数的影响

从表5来看，在3种稀释液中，添加磷酸盐稀释液的精子存活指数最大。显著的高于其他两组，而柠檬酸－Tris稀释液显著高于猪精液稀释液组。

3 讨论

3．1 柠檬酸－Tris稀释液对鸡精液体外常温保存的影响柠檬酸是一种重要的有机酸，它是一种三羧酸类化合物。Tris又叫三羟甲基氨基甲烷。由于Tris缓冲液为弱碱性溶液。柠檬酸－Tris稀释液也能适当的提高精子的活力以及保存时间。柠檬酸－Tris稀释液一般用于牛精液的冷冻保存，从未运用到鸡精液的常温保存。本次试验尝试将柠檬酸－Tris稀释液运用到鸡精液的常温保存中去，效果不是很明显［7］。

3．2 磷酸盐稀释液对鸡精液体外常温保存的影响

磷酸盐缓冲液（简称PBS）是常用的用于生物学研究的一个缓冲溶液。缓冲液有助于保持恒定的pH值。解决方案的渗透压和离子浓度。通常与畜体pH值相近等渗［8］。试验中运用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠作为缓冲液，鸡的精液用这种稀释液后，能提高精子的活力、存活时间，也能降低精子的畸形率，对于鸡精液的常温保存有非常显著的影响。

3．3 猪精液稀释液对鸡精液体外常温保存的影响

猪精液稀释液一般用于猪的精液的常温保存。本试验所用的猪精液的稀释液多为碳酸氢钠、氨苯磺胺、柠檬酸钠以及安钠咖按照一定比例配置而成［9］。猪精液稀释液以前从来没有用到鸡精液的常温保存中，对于鸡精液的常温保存，效果不是很明显［10］。

3．4 3种精液稀释液对鸡精液常温保存的影响这3种稀释液中，在柠檬酸－Tris稀释液中精子活力较强，猪精液稀释液中精子活力最弱，在磷酸盐稀释液中精子活力最强。并且在磷酸盐稀释液中精子的存活时间和存活指数都强于其他两种稀释液。在柠檬酸－Tris稀释液中精子的畸形率最高，猪精液稀释液中精子畸形率较低，而在磷酸盐稀释液中精子的畸形率最低。在柠檬酸－Tris稀释液中精子的顶体完整率最高，在磷酸盐稀释液中精子的顶体完整率较高，在猪精液稀释液中精子的顶体完整率最低。