董佳馨，李良昌，郑海锋*

（1.延边大学医学院，吉林 延吉 133002；2.延边大学附属医院ICU，吉林 延吉 133000）

心脏组织中，成纤维细胞占非心肌细胞的90%，并分泌细胞外基质蛋白如胶原蛋白。除了维持细胞外基质中的作用外，成纤维细胞还与心肌细胞通过缝隙连接进行偶联[1]影响心肌细胞的电生理活性，从而发生异位起搏。很多学者已经证明了成纤维细胞表达内向整流钾通道，钙激活钾通道，电压依赖性钠通道，容量敏感性氯通道[2]。改变这些通道的活性会使成纤维细胞的膜电位超级化或者去极化，进而通过缝隙连接改变心肌细胞的膜电位，使心肌细胞的兴奋性改变，影响心肌细胞的电生理活性和收缩。钙激活氯通道（Ca2+-activated chloride channel，CaCC）广泛分布于各个组织，参与多种细胞生理活动，如神经信号传导，动作电位形成，平滑肌收缩等。Anoctamin 1（Ano1）是CaCC的分子基础，但Ano1在心脏成纤维细胞的功能表达目前还不清楚。因此本研究中，我们利用分子生物学方法，膜片钳技术证实Ano1在成纤维细胞的表达，为深入研究该通道在心肌纤维化，异位起搏点形成机制提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 实验动物

C57BL/6小鼠，雌雄不拘，8～16周龄。由延边大学实验动物中心提供。使用乙醚麻醉的方法处死小鼠。

1.2 单细胞分离

使用改进的方法对心脏成纤维细胞进行分离：小鼠处死后迅速打开胸腔取出心脏，将心脏置于无钙液中，剥离出心房，用剪刀将心房剪成0.3*0.3*0.3cm的组织块，加入1%的II型胶原酶，37°C水浴。消化25分钟后去除消化液，用无钙液将消化酶洗脱10次。用前段细小的玻璃管吹打组织，使细胞从组织中脱离出来。成纤维细胞在倒置纤维镜下辨别。

1.3 成纤维细胞的收集

将急性分离出的心房成纤维细胞与APC欧联的抗Thy-1抗体孵育2 h。Thy-1阳性成纤维细胞利用流式细胞仪进行分选，进而对成纤维细胞收集。分选出的成纤维细胞用于RT-PCR和Western blot检测。

1.4 RT-PCR检测Ano1表达

收集到成纤维细胞后按TRIzol法提取总RNA。以RNA为模板在Super ScriptTM II逆转录酶的作用下合成cDNA并进行PCR扩增。Ano1上游引物为TTCGAGGAGGAGGAGGAAGC；下游引物为CAGCTTCACCTTGTCGGTCT。利用此引物所得的产物长度为195 bp。取RT-PCR 产物在2%琼脂糖凝胶上（0.03%溴化乙锭）电泳，70 V 40 min，凝胶图像成像系统拍摄实验结果。

1.5 Western blot

收集得到的心房成纤维细胞进行裂解提取细胞内蛋白，BCA法定量蛋白后各组样品均加样40µg，SDS-PAGE电泳分离后，转移至PVDF膜上。50 g/L脱脂奶粉封闭1.5 h，加50 g/L BSA稀释Ano1多克隆抗体过夜后，TBST洗膜3次，6 min/次；分别加HRP标记二抗，室温孵育2 h，ECL化学发光剂暗室显影。

1.6 膜片钳记录

用两步拉制仪将玻璃毛细管制备成尖端阻抗为2～5 MΩ玻璃电极。细胞分离后，选择贴壁好，外壁完整，折光度好的细胞进行实验。轻吸电极使得电极与细胞膜间形成高阻封接，阻值1 GΩ以上，破膜后即形成全细胞记录模式。使用膜片钳放大器、数模转换装置、Pclamp 10.1软件采集数据，所得的数据采用Clampfit及MICROCAL-ORIGIN（5.0）分析及绘图。

1.7 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以“±s”表示，采用t检验；计数资料以百分数（%），例（n）表示，采用x2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Ano1在心房成纤维细胞上的mRNA表达

Ano1的mRNA表达在小肠肌肉层组织（small intestine，SI）和心房成纤维细胞上同时进行了检测。因为小肠组织高水平表达Ano1，所以小肠用于阳性对照。和小肠组织相同，心房成纤维细胞Ano1的 mRNA表达RT-PCR结果表明，在200 bp 附近出现特异性条带，与预期的目的片段大小相符。见图1。这一结果表明小鼠心房成纤维细胞中Ano1在mRNA水平表达稳定。

2.2 Ano1蛋白在心房成纤维细胞上的表达

利用western blot方法对Ano1蛋白在小肠组织和成纤维细胞中的表达进行检测。小肠组织和成纤维细胞上均有大约100kDa的蛋白表达。这一蛋白大小与Ano1蛋白一致，表明与小肠组织一样，成纤维细胞也表达Ano1蛋白，见图2。

图1 Ano1在心房成纤维细胞中的表达

图2 Ano1蛋白在心房成纤维细胞中的表达

2.3 Ano1 在心房成纤维细胞上的功能表达

利用全细胞模式，钳制电压为-80 mV，阶跃电压从-70～+70 mV逐渐去极化（阶跃电压10 mV，持续时间500 ms）. 当电极内液含有0 nM游离Ca2+时，没有记录到任何电流（n=6，-70 mV下电流值为0.01±0.002 pA）；而当细胞内钙 增加到500 nM时，氯电流被记录到（70 mV下电流值为（83.6±4.4）pA；n=6，P＜0.01，见图3）。这一结果表明这一氯电流为CaCC。为了进一步确认Ano1为CaCC的分子基础。我们使用了Ano1特异性的阻断剂CaCCinh。10 µm CaCCinh在-70mV下抑制了CaCC大约50%（从（-83.5±4.2））到（-46.2±8.1）pA；n=6，P＜0.01，见图4。）

3 讨 论

近年来研究证明心脏在mRNA水平和蛋白水平表达Ano1[3]。但是没有直接证据通过膜片钳技术证明Ano1的功能表达。这可能是因为对Ano1的大部分的研究是在心肌细胞上进行的，而在心肌细胞上虽然具有Ano1表达，但是并不具有功能性，或者Ano1受到其他因素的影响，在心肌细胞中不能发挥其功能。一些学者发现在原代培养的新生乳鼠的心肌细胞上表达Ano1并具有功能性[4]。有可能Ano1在心肌成熟过程中发挥一些作用，但是在成年心肌细胞中功能表达并不清楚。再有细胞在培养过程中有可能发生变异，这会使实验结果发生一些偏差。以上结果表明，Ano1在心肌细胞的功能表达不是很明确的。而我们通过膜片钳技术直接证明了Ano1在成纤维细胞中功能表达。这与其他学者的发现有些不同。它的生理学意义需要我们进一步探讨。

Ano1编码CaCC，所以它的重要的调节物质是钙离子。心脏成纤维细胞表达Trp 通道，通过Trp通道细胞外钙离子可以进入细胞内，使细胞内钙浓度增加。这些钙除了可以使成纤维细胞增生，转变成肌成纤维细胞以外，还可以增加Ano1的活性。由于成纤维细胞可以通过缝隙链接可以和心肌细胞形成电偶联，Ano1被激活可以引起细胞膜的去极化，所以成纤维细胞的膜电位改变有可能改变心肌细胞的膜电位，从而改变心肌细胞的兴奋性。在胃肠道平滑肌，卡氏间质细胞表达Ano1[5]。Ano1是卡氏间质细胞产生慢波电位的通道基础，通过缝隙链接慢波电位促使平滑肌去极化，然后激活平滑肌上的L-型钙通道，进而引起平滑肌收缩[5]。所以Ano1在成纤维细胞的表达可能在心肌重朔引起的心律失常中发挥重要作用。

图3 在成纤维细胞中记录到CaCC

图4 Ano1阻断剂抑制CaCC

[1] Rook MB,Jongsma HJ,de Jonge B.Single channel currents of homo- and heterologous gap junctions between cardiac ベbroblasts and myocytes[J] . Pぼugers Arch. 1989 May;414(1):95-98.

[2] Li GR,Sun HY,Chen JB,et al.Characterization of multiple ion channels in cultured human cardiac fibroblasts[J] .PLoS One.2009;4(10):e7307.