摘要：在本次实验研究中，我们利用了双液相媒化学技术来制取茶色素，并且以单液相系统进行茶多酚酶促氧化，进而将单液相制取茶色素作为对照组。在加入氧载体之后构成了双液相酶化学氧化系统，其中对溶解氧浓度，茶黄素类（TFs）含量，高效液相图谱分析，茶多酚氧化酶（PPO）和茶红素类进行分析。最终，我们在合成制品中TFs的高效液相色谱的研究中发现，TOP1和TFs的响应值以及峰面积均要高于TOP2制品中的TFs，尤其是TFG与TFDG这两者的响应值较高，TOP-1的制品中儿茶素类残留量相比对照组来说较少，尤其是简单儿茶素的残留量更少。

关键词：双液相;酶化学;制取;茶色素

一、 国内外茶色素制取的现状

茶色素是茶叶中一种独特的多酚类氧化缩聚物，是利用茶发酵而形成的茶色素，具有抗氧化和清除体内自由基的作用，目前已经被广泛用于心脑血管疾病治疗，动脉粥样硬化治疗。降低血压、血脂等药物的研究中，可以从红茶中提取有茶色素，但是这种方法获取的茶色素效率较低，提取质量较差，而且分离纯化难度较高。近年来，国内外采用了体外酶促模拟发酵的方法或者通过有机合成来进行茶色素的形成与制取，且已经取得一定的成就。由于酶具有高效性和专一性催化，研究学者高度重视酶的反应特征，通过利用酶反应催化以及微生物来进行化学合成，并将其作为新的酶工程研究——酶化学技术。目前在有机合成的研究中，酶的使用范围不断扩大，尤其是在一些手性化合物的合成中，酶起到了关键的作用。比如茶黄素类的合成，利用PPO能够高效制取，儿茶素结构中的C2—H与C3—H键的存在能够保留在茶黄素的结构中。酶化学技术通常是在水介质中进行，在该介质中制取茶色素溶氧量较低，而且氧气作为茶色素形成的重要底物之一，由于溶氧量受到限制而抑制了茶色素的形成。为了增加溶解氧浓度，在单液相中加入与水不相溶的有机液相，这样构成了双液相系统，经过研究发现，在茶多酚酶促氧化条件下，相比单液相来说，这种双液相系统的溶氧量提高了两倍多，而且酶的稳定性也相对增强，活性提高了百分之两百。自20世纪50年代以来，国内外有关学者针对茶发酵实质以及反应机理展开研究，茶叶匀浆悬浮液的发酵，体外酶性或者一些非酶性的氧化儿茶素，进而制取茶色素。但是在双液相系统中，通过酶化学技术制取茶色素的相关研究比较少。在双液相体系中，我们应用酶来催化氧化茶多酚，进而制取茶色素，尤其是制取一些含有较低浓度咖啡碱，而高浓度茶黄素的生物活性的茶橙素制品，目前已经取得了不错的成绩。

二、 研究方法

在本次研究过程中，我们所需要的有机溶剂均为分析纯，包括乙酸乙酯，正丁醇，油酸，正己烷等，利用吸附树脂NKA=9的柱子进行分离制备茶色素。所使用的仪器有：溶氧分析仪，生物反应器，LZB型玻璃转子流量计。

在具体的方法中，我们利用了双液相酶化学技术来制取茶色素。首先称取5克的茶多酚，加入500mL柠檬酸——磷酸氢二钠的缓冲液中，最终调节pH为5.6，溶解之后加入500mL的OV-4以及40mL的酶制剂，通入每分钟20mL的氧气，在27℃的温度下进行酶促反应，经过1.5小时之后反应完成，分离油相，利用旋转蒸馏浓缩干燥获得茶橙色素，（TOP-1）水相经过吸附树脂柱层析春花看，用80%的乙醇洗脱，经过减压蒸馏浓缩后得到茶红色素。在对照组实验中，我们利用了单液相酶化学技术来制取茶色素，这里的方法如上述所示，但是我们没有添加氧载体OV-4，最终制得的样品为茶橙素和茶红色素。提取分离茶多酚氧化酶，通过双液相系统中多酚氧化酶的活性进行测定中，由于在双液相系统中，酶主要分布于水相中，在水相中进行氧化催化实验，由于反应中存在大量的茶多酚底物，在测定茶多酚氧化酶活性时，需要进行去除。具体方法是将聚酰胺柱子中加入 5mL 的反应液，流出滤液中不会显示酚性反应，取3mL的氯液用于茶多酚氧化酶活性分光光度计的测定，利用高效液相色谱分析茶色素和儿茶素。

三、 研究结果

1. 筛选双液相的油相。再利用单液相系统制取茶色素过程中，由于水中溶解氧的含量不足，而导致茶色素形成受到限制，在1984年Robertson A的实验表明，茶叶体外酶促氧化过程中体系中，有由于溶氧量较低，在20℃时，每个大气压溶氧量仅能达到3%，而其实茶叶体外外酶促氧化过程中20%的溶氧量是反应的最适浓度。在双液相系统中，由于加入了油相而提高了氧气的溶解量，有效解决了上述氧气不足的问题。因而油相的筛选是比较重要的。茶色素可以分为药用色素和天然食用色素，再进行油相筛选过程中，应当考虑到经济因素，筛选出一些溶氧量较高，茶多酚容量大，茶多酚氧化酶和分布较好，稳定性强，活性较高，且对环境没有污染，无毒，成本低，易回收的有机溶剂。经过对多种有机溶剂进行实验，我们最终认为OV-4作为氧载体是比较好的，分别对茶多酚氧化酶和溶氧量浓度，茶色素的形成量進行分析。

2. 水相中OV-4的体积比以及溶氧量的变化。在之前的研究中，我们发现在有机溶剂中，氧气的溶解度远远高于水中，因而采用水相-油相的双液相体系能够大大增强氧气的溶解量，提高氧的传递效率。我们将对氧气较高溶解度而不溶于水的有机溶剂中氧载体。而OV-4就是一种比较好的氧载体。研究表明，有机溶剂OV-4的铺展系数为正，其体积传递系数会随着油相体积百分数增大而增大，而且与此同时，氧溶量也会增加，当油相体积比达到25%以上时，溶氧量增加会变慢。

3. 溶氧量对于茶色素形成的影响。在进行制取茶色素的过程中，氧气是茶多酚氧化反应中重要的底物，由于茶多酚氧化酶对于氧存在较大的米氏常数，低氧浓度不利于儿茶素的酶促氧化过程，尤其是EC和ECG不能与EGC与EGCG这些进行配对缩合姘环反应，而导致茶黄素合成受到抑制，进而茶红素的合成也会受到一定的影响。然而，在双液相系统制取茶色素时，由于增加了溶解氧的供给，进而提高了酶促氧化的反应过程，提高了茶黄色和茶红素的合成含量，具体的实验数据如下表所示。

表1水-OV-4双液相体积与溶氧量

油相/水相（v/vx100）溶氧量（mg/L）05.21012.11514.22016.53018.54019.55020表2供氧量与TFs形成含量

反应时间水-OV-4双液相单液相溶氧量TFs含量溶氧量TFs含量0————0.513.4801.271122.81603.8781. 524.61908.480225.221411.880324.82389.878从表中我们发现双液相系统制取茶色素过程中，随着不断通氧进行酶促氧化反应，溶氧浓度迅速增加，进而茶黄素的含量也不断累积，在反应后三小时，茶黄素的和茶红素合成速度会达到高峰，也证明在双液相系统中，当氧气的流速为每分钟20mL是最适反应条件，在这个条件下茶黄素的含量是利用单向系统合成茶黄素的三倍，在单液相体系中，虽然溶氧量也有所提升，但相比双液相溶氧量来说，仅为20%以下，从而从一定程度上抑制了茶色素的形成。

4. 双液相系统中茶多酚氧化酶的活性。在双液相系统中由于增加溶氧量，而使得茶多酚氧化酶的活性得以提高，经过研究，我们发现在双液相系统中茶多酚氧化酶，由于催化茶多酚形成茶色素，经过两个小时的反应时间后，茶多酚氧化酶的活性达到最大值之后，活性会逐渐降低，在反应三小时之后，茶多酚氧化酶的活性为135%，然而在单液相系统中，茶多酚氧化酶的活力是逐渐降低的，在反应三小时之后酶的活性仅为双液相系统的一半。

5. 底物的浓度对茶色素形成的影响。在茶色素的反应过程中，随着底物浓度增大，茶色素的合成率也相应增加，但当底物浓度达到某一高浓度时，对茶多酚氧化酶的活性产生抑制，因此在制取茶色素的过程中，应当选择适当的底物浓度，在双液相反应系统中，70%的底物茶多酚会进入油相，其余30%进入水相，茶多酚氧化酶会进入水相，因而茶多酚氧化酶催化氧化茶多酚的反应发生在水相，其产物主要分布在水相，然而茶色素却进入了油相，活跃平衡分布，比如水相中茶多酚经过氧化之后，会从油相中得到补充。国外研究学者在体外模拟发酵和酶催化查茶儿茶色素形成茶色素时，采用的是1%的茶多酚浓度，而在双液相系统的研究中，我们利用了2%的茶多酚浓度。在过去的研究中表明，在双液相系统中酶的平衡理论和动力学，可以将该理论用于实践指导。

6. 茶色素制品的化学成分。天然制成的茶色素中主要的成分包括TFs和TRs，茶色素制品根据工艺流程获得的茶橙色素与红色素中，茶橙色素的主要成分为TFs和TRSI，而茶红色素的主要成分为TRSII和TRSIa。我们在本次实验中，主要分析茶橙色素的化学组成，通过高效液相色谱分析发现，在双液相系统中茶橙色素与单液相制品中的茶色素的化学成分，吸收峰能够明显辨别，通过保留时间可以发现其与茶红色素的组成成分是比较相似的。尤其对于TFs的成分来说，它们的响应值是重叠的，而TRSI的组成成分相比茶红色素来说大大降低。

茶色素中主要包括了茶黄色素和茶红色素，而茶黄素类包括了茶黄素与茶黄酸，茶红素类包括多种成分，它们的色谱行为与光谱特征均有所差异。茶黄素类是一种苯苯骈草酚酮的衍生物。苯骈草酚酮的核上具有多个酚羟基和羰基。其中通过C2—C6以及C2—C4化学键可以与两个苯骈二氧吡喃环相连接，虽然是单键相连，但由于受到空间位阻的影响，而使得自由旋转受阻，具有一定构象，具有特异的生理活性，比如能够抗凝、降低血脂等。茶黄素形成需要儿茶素与没有食子集儿茶素配对，在B环上的邻位二羟基与B环上连位三羟基酸配对，在茶多酚氧化酶的催化下进行氧化骈环形成。茶黄酸也属于茶骈草酚酮的衍生物之一，它的结构中含有多个羟基、羰基和羧基。茶黄酸类极易溶于水，齐极性较大，尤其可以溶于乙酸乙酯。在过去的研究中，认为苯黄酸类在红茶中含量较少，制茶发酵中很活跃，很容易转化为茶红素类。茶磺酸是由表儿茶没食子酸质以及没食子酸氧化瓶还而形成的。茶红素是一种异质酚性色素物质，它的分子量不等，大概范围为700到4万，差异比较明显，极性相比茶黄素类来说较强，而且化学组分结构更加复杂，至今还没有分离出茶红素类的单体，只是将其层析或者溶剂萃取分成若干的成分进行研究。

四、 小结

在本次研究中我们比较了双液相系统以及单液相系统酶化学技术在提取茶色素的区别。结果发现，双液相酶化学氧化系统中，由于茶多酚氧化酶的活性，溶解氧浓度都相应增强，因而使得最终制取的茶色素含量较高。

参考文献：

[1]萧伟祥，李立祥，萧慧.茶色素制取的生物化学[J].蚕桑茶叶通讯，2003（1）：5-7.

[2]罗学平，李丽霞，成洲，等.茶多酚氧化产物制备方法研究进展[J].南方农业，2017，11（22）：96-99.

[3]杜欢欢.茶叶中茶多酚、茶色素检测技术研究及茶多酚快速检测技术构建[D].汉中：陕西理工大学，2017.

[4]李立祥.茶色素形成机理及制取新工艺研究[D].合肥：安徽农业大学，2002.

作者簡介：

李淑莲，宁夏回族自治区银川市，宁夏工商职业技术学院能源化工学院。