桑 晓 王立娜 姜 悦 马明珠 王集会

(山东中医药大学，山东 济南 250355)

工艺·试验

《Technology&Experiment》

HPLC柱前衍生化测定野生与养殖全蝎中游离牛磺酸含量

桑 晓 王立娜 姜 悦 马明珠 王集会

(山东中医药大学，山东 济南 250355)

采用水提法提取野生全蝎与养殖全蝎中的游离牛磺酸，PITC柱前衍生化后进行反相高效液相色谱分析，用高效液相外标一点法测牛磺酸含量。牛磺酸在0.008 4～0.420 8 μg范围内呈良好的线性关系(R2=0.999 8);加样回收RSD为1.38%(n=6)；精密度RSD=1.14%(n=6)。该方法灵敏度高，重复性好，回收率高，可用于全蝎的质量检测与控制。

养殖全蝎 野生全蝎 牛磺酸 含量 衍生化

全蝎为钳蝎科动物东亚钳蝎ButhusmartensiiKarsch的干燥体，辛、平、有毒。具有息风镇痉、攻毒散结，通络止痛之功效。临床上用于治疗惊风、抽搐痉挛、中风口渴、半身不遂、破伤风、风湿麻痹、偏正头痛、疮疡、瘰疬等[1]。全蝎药材质量受其生长环境、蝎龄、性别、采收时间、产地加工方法等多种因素的影响。目前，野生全蝎资源稀少，人工养殖全蝎已经成功，野生全蝎和养殖全蝎一样可以入药。因此，通过研究野生全蝎与养殖全蝎中有效成分含量的对比，对控制其质量有重要意义。

全蝎用于息风镇痉，与牛磺酸的镇静、抗血小板聚集、抗惊厥作用类同，可以认为牛磺酸是全蝎有效成分之一[2]。因此野生全蝎与养殖全蝎中牛磺酸含量，可以作为评价野生全蝎与养殖全蝎的质量指标。牛磺酸的测定方法有分光光度法[3]、自动电位滴定法[4]、薄层扫描法[5]、氨基酸自动分析仪法[6]、柱后衍生法[7]、柱前衍生高效液相法等。其中，因为液相色谱法准确度和精密度较好，仪器普及率较高，因此柱前衍生化高效液相色谱法已被国家标准GB5009.169-2003收录作为测定牛磺酸的第一法[8]。目前常用的柱前衍生试剂有邻苯二甲醛(OPA)[9]、2,4-二硝基氟苯(DNFB)[10]、异硫氰酸苯酯(PITC)等。OPA衍生法速度迅速，但不能同时衍生一、二级氨基酸且衍生产物不稳定[11]。以PITC作为柱前衍生剂的氨基酸分析方法以其反应速度快，产物单一、稳定、与一级、二级氨基酸均可反应等特点而得到广泛的应用[12],与紫外检测器结合灵敏度高,检测限低。

本研究采用异硫氰酸苯酯(PITC)为衍生试剂，建立了野生全蝎与养殖全蝎中牛磺酸的反相高效液相测定方法。所建立的条件方法稳定性高、操作简单、准确可靠，具有较高的灵敏度，可用于全蝎中游离牛磺酸含量的测定。

1 材 料

1.1 药材与试剂

正己烷，冰醋酸、乙酸钠为色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司生产；乙腈、甲醇为色谱纯，上海星可高纯溶剂有限公司生产；三乙胺为色谱纯，天津市化学试剂一厂生产；娃哈哈纯净水，娃哈哈公司生产；牛磺酸标准品，中国食品药品检定研究院生产;异硫氰酸苯酯(PITC)，阿拉丁。

野生全蝎和养殖全蝎均购自山东临沂，均为活蝎，经山东中医药大学生药系徐陵川教授鉴定为钳蝎科东亚钳蝎ButhusmartensiiKarsch。选择成年蝎，剔除幼蝎，冻死，粉碎成匀浆，冷冻干燥成粉。养殖全蝎也购自山东临沂，选择成年蝎，剔除幼蝎。养殖全蝎与野生全蝎同法处理。

1.2 仪器

FA1004N型电子分析天平(上海精密仪器有限公司出品)； KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司出品)；LC-10AT VP(日本岛津公司出品)；Mettler AE240 电子天平(瑞士梅特勒公司出品)；LGJ_-18A冷冻干燥离心机(北京四环科学仪器厂有限公司)。

2 方 法

2.1 溶液的配制[13]

2.1.1 衍生化试剂的配制:精密量取0.3 mL PITC，置于25 mL的棕色量瓶中，用乙腈稀释至刻度，浓度为0.1 mol·L-1，摇匀，4 ℃保存，作为PITC的乙腈溶液；精密量取14 mL三乙胺，置于100 mL棕色量瓶中，用乙腈稀释至刻度，浓度为1 mol·L-1，摇匀，作为三乙胺的乙腈溶液。

2.1.2 对照品溶液制备：精密的称取牛磺酸对照品10.43 mg，用蒸馏水溶解并定容至25 mL制成质量浓度为0.4177 mg.mL-1的对照品溶液A。

2.1.3 样品溶液的制备：精密称取两种全蝎粉末各0.500 0 g，按最佳超声提取工艺提取，定容至100 mL。

2.1.4 衍生化步骤：精密吸取待分析溶液5 mL于25 mL棕色量瓶中，精密加入0.1 mol.L-1PITC的乙腈溶液2.5 mL，1 mol.L-1三乙胺的乙腈溶液2.5 mL，摇匀，室温放置1 h后，加50%的乙腈稀释至刻度，摇匀。精密移取5 mL，加入5 mL正己烷，振摇后放置10 min，取下层溶液，用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，取续滤液，既得。

2.1.5 空白溶液的制备: 精密吸取5 mL蒸馏水于25 mL棕色容量瓶中，按上述方法进行衍生化。

2.2 色谱条件[13]

2.2.1 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(150 nm×4.6 nm，5 μm)以0.07 mol.L-1醋酸-醋酸钠缓冲液-2.5%乙腈(pH=6.5)为流动相A，以乙腈-甲醇-水(40∶15∶45)为流动相B进行梯度洗脱：0～15 min 96.5%→89%A，15～30 min 89%→0%A，30～45 min 0%A，检测波长为254 nm，流速为1.0 mL.min-1，进样量为5μL。用外标一点法测定牛磺酸含量。在上述条件下分别获得空白、标准品、野生全蝎和养殖全蝎衍生化后的牛磺酸色谱图，见图1、图2、图3、图4。

2.2.2方法学考察

2.2.2.1 线性关系考察:分别精密吸取上述对照品溶液(质量浓度为0.417 7 mg·mL-1)用水稀释成6个不同浓度的对照品稀释液，按上述方法进行衍生化并按上述色谱条件测定峰面积，以牛磺酸对照品进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积值为纵坐标(Y)，以最小二乘法计算回归方程。结果见图5。

2.2.2.2 精密度试验：取上述对照品溶液进行衍生化并测定峰面积，连续进样6次。

2.2.2.3 加样回收率试验：称取已知牛磺酸含量的样品6份，每份0.125 0 g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入牛磺酸对照品溶液(质量浓度为0.420 8 mg·mL-1)1.0 mL，水7 mL，6 mL、6 mL，按最佳超声工艺超声，制备样品溶液，进行色谱分析，计算回收率，结果见表1。

2.2.2.4 重复性试验：称取养殖全蝎样品6份，精密称定，按照“2.1.3”中的方法制备样品溶液，按上述方法进行衍生化并按上述色谱条件测定峰面积，计算牛磺酸含量。

2.2.3 含量测定：取三批野生全蝎和养殖全蝎样品，精密称定，按照“2.1.3”中的方法制备样品溶液，按上述方法进行衍生化并按上述色谱条件测定峰面积，计算样品中牛磺酸含量，结果见表2。

3 结 果

3.1 高效液相色谱图

图1 空白溶液Fig 1 Blank solution

图2 标准品Fig 2 Standard product

图3 野生全蝎Fig 3 Wild scorpion

图4 养殖全蝎Fig 4 Domesticated scorpion

3.2 标准曲线方程及线性范围

回归方程为Y=3E+06X+6083.4 r=0.9998;表明牛磺酸在0.0084-0.4208 μg范围内，进样量与峰面积之间呈良好的线性关系。见图5。

图5 牛磺酸标准曲线图Fig 5 Standard curve of taurine

3.3 精密度

取上述对照品溶液进行衍生化并测定峰面积，连续进样6次。计算峰其面积的RSD为1.14%(n=6)，结果表明精密度良好。

3.4 加样回收率试验结果见表1

表1 牛磺酸加样回收试验结果Table 1 Results of taurine addition n=6

3.5 重复性试验结果

计算得牛磺酸平均含量为1.1267%，RSD=1.39%(n=6)，表明重复性良好。

3.6 含量测定结果

表2 三批样品中游离牛磺酸的含量测定结果Table 2 Determination of free taurinein three batches of samples n=3

4 讨 论

全蝎中除含有牛磺酸成分外，还有蝎毒素、Ca、Mg、Fe等微量元素。但是蝎毒素单体(活性多肽)的分离、纯化操作过于繁琐，结构鉴定较困难，很难满足作为定量分析用化学对照品在纯度、数量上的要求。而全蝎中牛磺酸的提取相对简单，又是息风镇痉有效成分之一，所以选择牛磺酸作为野生全蝎与养殖全蝎的质量控制指标。

PITC柱前衍生法是利用PITC与氨基酸反应生成稳定的且具有强烈紫外吸收的苯氨基硫甲酰衍生物，然后再利用C18柱和带有二元梯度的高效液相色谱及紫外检测器测定。该方法能够用于对全部氨基酸(包括一级胺和二级胺)的测定，检测限低，线性好，重现性好。本文考察了进样5μL和20μL对色谱峰的影响，结果表明进样5μL出峰效果好，分离度大；进样20μL虽然可以提高检测的灵敏度和准确度，但是分离度低，容易出现峰变宽、拖尾的现象，并且PITC毒性大，极性小，对色谱柱损伤严重。

本实验所用的野生全蝎与养殖全蝎样品均购自山东临沂，经鉴定均为东亚钳蝎ButhusmartensiiKarsch，药材为全蝎冻干粉。通过对野生全蝎与养殖全蝎牛磺酸含量的测定，结果表明，养殖全蝎与野生全蝎相比，养殖全蝎中牛磺酸含量相对较高，推测人工养殖全蝎的生长环境比野生全蝎的生长环境更为适合全蝎的生长，食物较为充足，因此牛磺酸含量相对较高。

[1] 陈秀敏.全蝎不良反应分析[J].时珍国医药,2003,14(10):635.

[2] 黄晓丹,侯少贞,李耿 等.中药有效成分牛磺酸综述[J].中国民间疗法,2005,13(9):64～65.

[3] 李秀娟，鲁曾，黄贤刚.牡蛎中牛磺酸含量测定方法的建立[J].食品与机械,2010,26(5):81～83.

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TheDeterminationofFreeTaurineContentsBytheRP-HPLC-PITCPrecolumnDerivatizationintheWildandDomesticatedScorpion

Sang Xiao Wang Lina Jiang Yue Ma Mingzhu Wang Jihui

(Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Shandong Jinan 250355)

The free taurine of the wild and domesticated scorpion were extracted with water respectively.The RP-HPLC-PITC precolumn derivatization were used to measure the contents of free taurine. The linearity of the taurine derivative was good in the range of 0.008 4～0.420 8 μg (r=0.999 8).The average recovery was 99.7% with RSD of 1.38% (n=6); precision RSD=1.14% (n=6). The method with high sensitivity, good reproducibility and high recovery rate, could be used for quality detection and control of scorpion.

Domesticated scorpion wild scorpion Taurine content derivatization

10.16597/j.cnki.issn.1002-154x.2017.03.006

2017-01-24

山东中医药大学大学生研究训练(SRT)计划资助项目(编号:2015315)；2015年国家级大学生创新创业训练计划项目(项目编号：201510441010)。

桑晓(1996～)，女，本科生，研究方向:制药工程；通讯作者：王集会(1962～)，男，副教授，研究方向:虫类中药发酵及活性成分研究，E-mail: wangjihui10@ 126. com。