刘 颖 刘春雨 曹广超 王彦多 王集会 史 磊

(山东中医药大学，山东 济南 250355)

科技进展

《AdvancesinScience&Technology》

美洲大蠊粉发酵前后水溶性活性物质含量对比研究

刘 颖 刘春雨 曹广超 王彦多 王集会 史 磊

(山东中医药大学，山东 济南 250355)

用水提法提取发酵前后美洲大蠊粉中的水溶活性物质，再分别采用定磷法、苯酚-硫酸法、改良Lowry 法测定总核酸、总糖、总蛋白质的含量，然后比较发酵前后的美洲大蠊粉中水溶性活性物质含量之间的差异。可知发酵前样品中总核酸含量为33.800 1 mg/g，总糖含量为14.187 3 mg/g，总蛋白质含量为100.016 6 mg/g，发酵后样品中总核酸含量为22.834 5 mg/g，总糖含量为11.024 9 mg/g，总蛋白质含量为197.493 6 mg/g。

美洲大蠊 发酵对比 总核酸 总糖 总蛋白

美洲大蠊Periplanetaamericana(L.)是一类有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，民间称之为蟑螂，早见于《神农本草经》[1]。大多以鲜成虫或干燥体入药，作为传统的中药材，其性味寒咸，具备散瘀、解毒、消肿、利水、消积等功用。现有临床研究证实，美洲大蠊在抗肿瘤、促进组织修复、抗氧化、抗菌抗病毒等方面有明显作用[2]。在本实验中，通过分别用定磷法[3]、苯酚-硫酸法[4]和改良Lowry法[5]对发酵前后的美洲大蠊粉中总核酸、总糖和总蛋白质含量的测定，奠定了下一步美洲大蠊药理性实验研究的基础。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

KQ-500E型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；ST16R高速冷冻离心机( 赛默飞世尔科技有限公司)；UV9100B型紫外可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)；HH-4数显恒温水浴锅(上海梅香仪器有限公司)；disb-zc型低温冷却循环水真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；FA11-4N 电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；766-2型远红外辐射干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司)。

1.2 试剂

牛血清蛋白(BSA，国药集团化学试剂有限公司)；碱性铜(用酒石酸钾钠、无水碳酸钠、硫酸铜、氢氧化钠(皆为分析纯)自制)；福林酚试剂( 批号: HCRB110320，国药集团上海化学试剂有限公司)；无水葡萄糖;浓硫酸；苯酚；磷酸二氢钾；定磷试剂(用浓硫酸、钼酸铵、抗坏血酸(皆为分析纯)自制)。美洲大蠊粉(批号:20160901)购自山东省临沂市沂水县，经山东中医药大学生药系高德民副教授鉴定为蜚蠊目蜚蠊科大蠊属美洲大蠊Periplanetaamericana(L.)；发酵美洲大蠊粉( 批号:20161101)由山东中医药大学实验室自制。

2 实验方法

2.1 发酵美洲大蠊粉的制备

称取适量美洲大蠊粉，加入活白僵菌孢子粉(100亿/g，山东农业科学院植物保护研究所自筛菌株-桃5)，加少量吐温-80，用75%乙醇稀释其成为含1×108个孢子的悬浊液。取适量悬浊液拌匀湿润，温度保持为25℃～28℃，湿度保持为95%，在恒湿恒温培养箱中发酵8 d左右，待菌丝长满后停止发酵。

2.2 美洲大蠊粉水提液的制备

精密称取美洲大蠊粉、发酵美洲大蠊粉各0.5 g于具塞锥形瓶中，加入15 mL蒸馏水，加塞超声20 min，抽滤后取残渣再重复上述步骤2次。将3次的提取液混合均匀，离心(3 000 r/min)10 min，再次抽滤，将抽滤液用50 mL容量瓶定容，得美洲大蠊粉水溶性提取物溶液。发酵前后美洲大蠊粉各水提3次。

2.3 定磷法测定总核酸的含量

2.3.1标准溶液制备

精密称取磷酸二氢钾(在110 ℃下烘干至恒重)0. 877 5 g 于100 mL烧杯中，用蒸馏水溶解后转移至500 mL 容量瓶，定容。再精密量取5.00 mL上述溶液，用100 mL容量瓶定容，配制为含磷20μg/mL的标准磷溶液。

2.3.2定磷试剂的制备

将蒸馏水、17%硫酸溶液、10%抗坏血酸溶液、2.5%钼酸铵溶液(现配现用)按体积比为2∶1∶1∶1配制成定磷试剂。

2.3.3标准曲线制备

分别量取标准磷溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL置于具塞试管中，补加蒸馏水至3.0 mL，再加入3.0 mL定磷试剂，混合均匀，加塞45 ℃水浴加热10 min，同时做空白实验，自然冷却后在660 nm波长处测定吸光度。以吸光度为横坐标，磷的质量为纵坐标，绘制出标准曲线，回归方程为y=0.020 7x-0.000 04，相关系数r=0.999 5。

2.3.3样品含量测定

2.3.3.1总磷含量测定

准确量取美洲大蠊粉水提液1.0 mL于5 mL小烧杯中，加入2.0 mL 10%硫酸溶液及2粒玻璃珠，于通风橱内大火加热至溶液为透明黑色(必须透明)，消化完成。冷却后将消化液移入25 mL容量瓶中，用少量蒸馏水洗涤烧杯和玻璃珠2次，洗涤液一并移入容量瓶中，加蒸馏水至刻度线。准确吸取3.0 mL上述溶液于具塞试管中，加入3.0 mL定磷试剂， 加塞在45 ℃水浴中加热10 min，同时做空白实验，自然冷却后在660 nm波长处测定吸光度。发酵前后美洲大蠊粉水提溶液分别平行测定3次，根据回归方程式计算出样品中总磷含量。

2.3.3.2沉淀剂的制备

取钼酸铵固体0.5 g，加入过氯酸7 mL及蒸馏水193mL溶解，得到沉淀剂。

2.3.3.3无机磷含量测定

分别准确量取发酵前后样品溶液1.0 mL，再加入沉淀剂9.0 mL，混合均匀，充分反应后离心( 3500 r /min)15 min，取上清液5 mL，用25 mL容量瓶定容。精密量取3.0 mL 稀释液于具塞试管中，加入定磷试剂3.0 mL，加塞45 ℃水浴加热10 min，同时做空白实验，自然冷却，在660 nm波长处测定吸光度。发酵前后美洲大蠊粉水提溶液各平行测定3 次。根据回归方程式计算出样品中无机磷含量。

2.3.3.4有机磷和核酸含量测定

有机磷 = 总磷 - 无机磷。核酸分子中含有一定比例的磷，一般RNA 和DNA及其核苷酸含磷质量分数分别为9% 和9.2%，换算后可知核酸量约为含磷量的11 倍，故通过计算有机磷的量，可求得核酸的量。(见表1)

2.4 苯酚-硫酸法测定总糖的含量

2.4.1标准溶液制备

精密称取干燥至恒重(两次称量误差不超过0.3 mg)的葡萄糖10.0 mg于50 mL烧杯中溶解，用100 mL容量瓶定容，备用。

2.4.2标准曲线制备

分别准确量取葡萄糖标准品溶液1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度。再分别量取2 mL上述溶液于具塞试管中，加入5%苯酚溶液 (现配现用)1 mL，混合均匀，快速加入浓硫酸5 mL，室温放置10 min后加塞40 ℃水浴保温15 min，同时做空白实验，在490 nm波长处测定吸光度。以吸光度为横坐标，葡萄糖的质量为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为y=0.128 9x+0.000 000 2，相关系数r=0.999 1.

2.4.3样品含量测定

精密量取2.2项下样品1 mL定容于10 mL容量瓶中，取2mL于具塞试管中，加入5%苯酚溶液1 mL，混合均匀后迅速加入浓硫酸5 mL，室温放置10 min后加塞40 ℃水浴保温15 min，同时做空白实验，取出后于490 nm测定吸光度。发酵前后美洲大蠊粉水提溶液各平行测定3次。根据回归方程计算样品中总糖的含量。(见表1)

2.5 改良Lowry法测定总蛋白的含量

2.5.1标准溶液的制备

精密称取20.0 mg牛血清蛋白于50 mL烧杯中溶解，移入100 mL容量瓶中用蒸馏水定容得200 μg /mL的标准溶液。

2.5.2标准曲线的制备

准确量取标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL置于试管中，补加蒸馏水至1 mL，再加入碱性铜溶液(现配现用)5 mL，混合均匀后室温放置10 min，快速加入福林酚试剂0. 5 mL，室温放置30 min后在650 nm波长处测定其吸光度，同时设置空白实验。以吸光度为横坐标，标准牛血清蛋白质量为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为y=0.500 8x-0.003 7，相关系数r=0.998 6.

2.5.3样品溶液的测定

精密量取美洲大蟾粉样品溶液1 mL于10 mL容量瓶中，加入蒸馏水定容。再精密量取1 mL置于试管中，加入碱性铜溶液5 mL，混合均匀，测定其吸光度，同时做空白实验。发酵前后美洲大蠊粉水提溶液各平行测定3 次。根据回归方程式计算出样品中总蛋白含量。(见表1)

3 结 果

表1 发酵前后美洲大蠊粉水溶性活性物质含量(x±s，mg/g)Table 1 content of water soluble active substances inPeriplaneta Americana powder before fermentation and after(x±s，mg/g)

由表可知发酵美洲大蠊粉的水提液中总核酸、总糖的含量均减少，而总蛋白质的含量增多。

4 讨 论

发酵是生物体运用自身调节来完成的，反应的专一性强，得到的代谢产物单一性好。白僵菌属于药用真菌，其在液体发酵过程中，除了孢子或者菌丝大量增殖外，还会在发酵液中产生生物碱、多糖、维生素、多肽、酶、萜类化合物、甾醇、核酸、氨基酸和类抗生素作用的具备生理活性的多种物质。这些物质分别对心血管、肾脏、肝脏、性器官、神经系统等具有防病治病的功效，此外还有抗癌、抗菌、抗炎、抗溃疡、抗衰老等作用。人们对药用真菌的液体发酵主要以获取以上次生代谢产物为目的[6]。

实验证明，美洲大蠊粉用白僵菌发酵后，蛋白质的含量明显增多，说明是由其他物质转化而来；核酸和总糖的含量减少，可能转化为了大量的蛋白质和少量的其他次生代谢产物(具体路径有待考察)。由此说明美洲大蠊粉的发酵过程中，由白僵菌转化产生的次生代谢产物主要为蛋白质，其含量明显增加约至一倍。而总糖和核酸的含量减少甚微，可忽略不计。这为下一步做发酵前后的美洲大蠊粉水提液抗肿瘤药效对比的药理实验奠定了基础。

[1] 何正春,彭芳,宋丽艳 等.美洲大蠊化学成分及药理作用研究进展[J].中国中药杂志,2007,(21):2 326～2 331.

[2] 罗廷顺,高孟婷,马芳芳 等.美洲大蠊药理作用及临床应用研究进展[J].安徽农业科学,2012,(10):5 933～5 935+5 942.

[3] 刘春雨,刘玉慧,李晓辉 等.蜈蚣粉发酵前后水溶性活性物质含量对比研究[J].湖南中医杂志,2016,(11):167～169.

[4] 杨贤庆,刘名求,戚勃 等.龙须菜中多糖含量测定方法的比较研究[J].食品工业科技,2013,(22):54～57.

[5] 闫萍,杨琦,王惠珍 等.改良Lowry法和Bradford法测定蚯蚓提取物中蛋白质含量的比较(英文)[J].山西医科大学学报,2006,(01):9～11.

[6] 李羿,杨胜,万德光.药用真菌液体发酵研究进展及存在问题探讨[J].中草药,2012,(10):2 066～2 070.

ComparativeReasearchontheContentofWater-SolubleActiveSubstancesbeforeandafterFermentationofPeriplanetaAmericana

Liu Ying Liu Chunyu Cao Guangchao Wang Yanduo Wang Jihui Shi Lei

(Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Shandong Jinan 250355)

The water-soluble active substance in periplaneta Americana powder before and after fermentation was extracted with water. The total nucleic acid, total sugar, and total protein content were determined by the methods of fixed phosphorus, phenol-sulfuric acid method and the improved Lowry method and the differences of the water-soluble active substance content in periplaneta Americana powder were compared between before and after fermentation. The results showed that the content of total nucleic acid was 33.800 1 mg,the content of total sugar was 14.187 3 mg,and the content of total protein was 100.016 6 mg per gram before fermentation and 22.834 5 mg、11.024 9 mg、197.493 6 mg per gram after fermentation.

Periplaneta Americana fermentation comparison total nucleic acid total sugar total protein

10.16597/j.cnki.issn.1002-154x.2017.03.001

2017-02-12

山东中医药大学大学生研究训练(SRT)计划资助项目(编号：2016016)。

刘颖，女，(1996～)，本科生，研究方向：制药工程。E-mail：17854111049@163.com；通信作者：史磊，男，(1983～)，博士，助教，研究方向：中药化学活性成分及中药质量控制研究，E-mail：15966605306@163.com。