吴聪冲 吴青青 喻夏昕 马芳笑 毛丹漪 刘晓谷⋆

·论著·

水飞蓟素对乳腺癌MCF-7/DOX细胞耐药性的逆转作用及机制研究

吴聪冲 吴青青 喻夏昕 马芳笑 毛丹漪 刘晓谷⋆

目的 探讨中药单体水飞蓟素（Sily）对人乳腺癌耐药细胞MCF-7/DOX耐药性的逆转作用及其机制。方法 （1）用MTS比色法测定阿霉素（DOX）对MCF-7/S 和MCF-7/DOX 的毒性作用，计算耐药倍数；加入Sily干预后与阳性药物对照组（Ver组）比较，评估Sily的逆转疗效。（2）用实时荧光定量PCR（RT-PCR）及免疫印迹（Western-blot）法分别检测Sily、Ver处理后，MCF-7与MCF-7/DOX细胞中多药耐药基因MDR1 mRNA及其产物 P-gp的变化。结果 （1）DOX对敏感细胞和耐药细胞的半数抑制浓度（IC50）分别为1.868μg/ml和60.625μg/ml，耐药倍数为32.45倍，Sily10μg/ml（存活率＞98%）作用于MCF-7/DOX 48h后，耐药细胞株的IC50降至12.757μg/ml，逆转倍数为4.75倍（P＜0.01）；（2）在Sily（10μg/ml）作用下，MDR1 mRNA及其编码的蛋白P-gp表达水平显著下降（P＜0.01）。结论 无细胞毒性剂量的水飞蓟素能够逆转MCF-7/DOX对DOX的耐药性，其逆转作用可能与下调MDR1 mRNA及其编码的蛋白P-gp的表达有关。

乳腺癌 水飞蓟素 P-糖蛋白 逆转耐药

Objective To investigate the reversal effect and mechanism of the traditional medicine monomer silymarin（Sily）on the drug resistance of human breast cancer cell MCF-7/DOX. Methods （1）MTS assay was adopted to determine the toxic effects of doxorubicin（DOX）on MCF-7/S and MCF-7/DOX，the multiple of drug resistance was calculated. When Sily was combined，the reversal effect with Verapamil（Ver）was evaluated as a positive control.（2）To test the changes of multidrug resistance gene MDR1 mRNA and its products P-gp after being treated with Sily and Ver by means of real-time PCR（RT-PCR）and western-blot respectively. Results （1）The IC50value of sensitive cell and resistant cell with DOX were 1.868μg/ml and 60.6μg/ml respectively，the multiple of drug resistance was 32.45 times. The IC50value of MCF-7/DOX declined to 12.757μg/ml and the reversal index was 4.75 times（P＜0.01）after the effect of Sily（10μg/ml）with a more than 98 percent survival rate，which was detected after 48 hours.（2）The expression level of MRD1 mRNA and the encoded proteins P-gp had signif i cantly decreased（P＜0.01）.Conclusions Noncytotoxic dose of Sily can reverse the DOX resistance of MCF-7/DOX，and the reversal effect is associated with the down-regulation of MRD1 mRNA and the expression of the encoded proteins P-gp.

Breast cancer Silymarin P-glycoprotein Drug resistance inversion

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。据2012年全球癌症报告数据显示［1］，全球每年新发乳腺癌病例约167.1万，死亡人数每年达52.2万，且呈逐年上升趋势。据中国癌症协会统计［2］，2015年中国乳腺癌新增患病人数已达26.86万人。乳腺癌作为实体瘤中化疗效果最佳的肿瘤之一，化疗在整个治疗中占重要地位，但多药耐药（multidrug resistance，MDR）现象的产生，降低较多抗癌药物（如阿霉素等）的临床疗效，成为乳腺癌化疗的失败主要原因。MDR发生机制复杂，临床上解决MDR的方法之一是使用逆转剂，寻找高效低毒的耐药逆转剂是当前乳腺癌治疗的研究热点。2016年5月至2017年3月作者通过实验研究，探讨中药水飞蓟素（Silymarin）对人乳腺癌耐药细胞MCF-7/DOX耐药性的逆转作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株 乳腺癌细胞株MCF-7/S购自中科院上海细胞库，具有多药耐药表型的耐阿霉素细胞株MCF-7/DOX由浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所提供。

1.2 药品、试剂及主要仪器 阿霉素（DOX）（深圳万乐药业有限公司）；水飞蓟素（Sily）（80%）干粉（西安小草植物科技有限责任公司）；维拉帕米（Ver）（上海禾丰制药有限公司）。DOX用注射用葡萄糖水配成10mg/ml的工作母液，Sily干粉先用DMSO溶解为500mg/ml的工作母液（DMSO 在无毒剂量内），分装后避光保存于-20℃冰箱，使用时用培养液配成相应浓度应用液。MTS（普洛麦格生物技术有限公司）；Takara PrimeScript RT Master mix［宝生物工程（大连）有限公司］；SYBR Premix EX TaqTM［宝生物工程（大连）有 限 公 司 ］；Trizol regent（Life Technologies USA）；Real-Time PCR仪器（美国罗氏公司）；微量核酸测量仪（one drop spectro photometer）；RIPA裂解液（上海生工生物工程有限公司）；红外激光双色成像系统（Gene Company Limited，odyssey）。

1.3 方法 （1）细胞培养：将敏感细胞株MCF-7/S置于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中，在37℃、饱和湿度及5%CO2的细胞培养箱内传代培养。耐药株MCF-7/DOX 培养在含1.0μg/ml的DOX的混合培养液中，培养条件同上。（2）MTS法实验：实验分为MCF-7/S组、MCF-7/DOX组、MCF-7/DOX+Sily组、MCF-7/DOX+Ver组。取MCF-7/S、MCF-7/DOX的细胞悬液接种在96孔板内，取对数生长期的MCF-7/DOX和MCF-7/S的细胞悬液100μl接种在96孔板内，作为MCF-7/S组、MCF-7/DOX组，并设立空白对照组（只含RM1640培养液）和阴性对照组（不加药物）作为对比。①测定无或低细胞毒作用的Sily的浓度：将敏感组、耐药组加入不同浓度的Sily，Ver干预，48h后加入MTS作用3h后用酶标仪（波长490nm）检测OD值，计算Sily，Ver无或低细胞毒性的浓度范围。②测定耐药组对DOX的耐药倍数：将敏感组、耐药组同时加入不同浓度的DOX48h后，加入MTS作用3h后用酶标仪（波长490nm）检测OD值，计算DOX对各组细胞的IC50和耐药倍数（RF）。③测定Sily对耐药组的逆转作用：在实验②基础上各组加入 Sily（根据①的结果取 10μg/ml）、Ver（5μg/ml），作为MCF-7/DOX+Sily组，MCF-7/DOX+Ver组进行干预，用酶标仪检测OD值，计算Sily、Ver作用前后耐药组IC50的变化，比较Sily与Ver的作用差异。上述实验每组设置3个复孔，重复6次。（3）RT-PCR法测定MDR1 mRNA表达：引物由上海生工合成。MDR1（NM_000927.4）F：5'-TACAGCACGGAAGGCCTAAT-3'，R ：5'-T C T T C A C C T C C A G G C T C A G T-3'，1 2 4 b p；β-a c t i n（N M_0 0 1 1 0 1.3）F：5'-AGTCATTCCAAATATGAGATGCGTT-3'，R：5'-GCTATCACCTCCCCTGTGTG-3'，121bp。取四组细胞适量，加入lml Trizol试剂，加氯仿、异丙醇、无水乙醇提取总RNA，测定密度值后，制备RT反应液。反应条件37℃15min，85℃5s，配成cDNA，加入至RT-PCR反应液，反应条件为95℃30s-95℃5s-60℃30s，41循环，每个样本均设3个复孔，内参照基因亦设3个复孔，重复3次。（4）Western-Blot法测定P-gp蛋白的表达：取4组细胞适量，加入150μl RIPA细胞裂解液裂解，用12%SDS-PAGE法分离蛋白质，后转移至PVDF膜上，分别加入P-gp抗体检测相应蛋白，过夜、洗膜，二抗遮光温育90min，洗膜，用红激光双色成像系统扫描成像，以β-ACTIN为内参抗体，比较各条带的吸光度值。实验平行重复3次。

1.4 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计量资料均以（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Sily对MCF-7/DOX耐药细胞的逆转作用 见表1。

表1 Sily对MCF-7/DOX耐药的逆转作用［n=18，（x±s）］

2.2 Sily 对MCF-7/DOX耐药细胞表达MDR1 mRNA的影响 见表2。

表2 各组MDR1 mRNA表达水平比较（x±s）

2.3 Sily对MCF-7/DOX耐药细胞表达P-gp蛋白的影响 见表3、图1。

表3 各组P-gp蛋白表达水平比较（x±s）

图1 Sily 对MCF-7/DOX耐药细胞表达P-gp蛋白的影响

3 讨论

乳腺癌的化疗治疗在其综合治疗中起着重要的作用，但由于多药耐药现象的产生，可通过影响信号传导通路及基因的表达，降低较多抗癌药物（如阿霉素）的生物活性和效能，成为乳腺癌化疗失败的主要原因［3-4］。临床传统克服MDR的方法之一是使用逆转剂，与目前新的纳米技术包埋法［5-6］比较，仍具有价格便宜，简单易行的优势。然而，由于人体生物利用度差或不良反应严重，亦导致其在临床应用受限。传统中医药具有治病祛邪、扶助正气、调理脏腑的功效，从中药中寻找高效低毒多靶点的耐药逆转剂的研究日益增多。本资料显示，10μg/ml（无细胞毒性）的Sily联合DOX作用于MCF-7/DOX后能显著提高DOX对乳腺癌耐药细胞株的杀伤作用，提高耐药细胞株对DOX的敏感性，具有逆转MCF-7/DOX对DOX耐药性的效果。同时与阳性对照组比较，中药水飞蓟素4.75倍的逆转作用，与Ver（逆转倍数为5.06倍）差异无统计学意义，相比文献中的其他逆转药如中药粉防己碱耐药对MCF-7/DOX的逆转倍数为2.0［7］，大黄素为2.86［8］，Sily具有明显的高效性特点，在临床应用中更具优势。

肿瘤多药耐药性是多基因、多阶段、多步骤和多因素作用的结果，其机制复杂［9-10］。最常见的耐药机制与位于细胞膜ATP结合盒的转运蛋白家族（ABC跨膜转运蛋白超家族）密切相关，其可以在较短的时间内有效将抗乳腺癌药物从细胞内泵出到细胞外，从而降低肿瘤细胞内药物含量，使抗肿瘤药物杀伤力明显减弱，导致用药过程中产生耐药性［11］。其中最重要的是由MDR1基因编码P-gp蛋白，其具有经典“药泵”功能，能通过耗能外排包括抗细胞增殖药物等外源性底物，与蒽环类药物（如阿霉素）的耐药密切相关［12］。而前期研究发现中药单体水飞蓟素对乳腺癌耐药细胞MCF-7/DOX有逆转作用，因此推测中药Sily的抗耐药性可能通过调节MDR1基因表达P-gp蛋白实现，但如何调节尚不清楚。故通过RT-PCR、Western-blot的方法，检测该基因在Sily干预下的变化。发现中药Sily能够明显下调MCF-7/DOX的MDR1的mRNA及相应蛋白P-gp的表达（P＜0.01），表明Sily的抗耐药性与调节该机制有关。此类研究在其他的研究中也得到证实。如Madhumita Roy等［13］研究发现中药姜黄素能够通过上调P-gp蛋白的表达逆转宫颈癌对顺铂的耐药性；文思群等［14］研究发现雷公藤内酯醇能够将K562/G01 细胞阻滞在G1期，下调P-gp蛋白和BCR/ABL基因表达等。

此外，据以往研究表明，Sily不仅对乳腺癌有防治效果［15］，还对结肠癌［16］、前列腺癌、膀胱癌［17］等多种癌症具有类似的效果，其抗癌机制呈现多靶点、多机制联合、全方位等特点。如Kai Jiang等［18］研究发现，水飞蓟素可以通过线粒体介导的凋亡途径诱导乳腺癌MCF-7细胞的凋亡；周大勇等［19］研究发现，水飞蓟宾（Sily提取物主要成分）具有明显的抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和促进其凋亡的效果，其作用机制与通过诱导PUMA蛋白表达有关；Rastegar等［20］研究发现，75μg/ml的Sily够能有效降低DOX的最佳有效剂量，增强DOX的治疗效果，两者联合具有协同作用。因此，在本实验中，作者推测水飞蓟素对MCF-7/DOX的逆转作用可能与多种通路相关。

［1］ Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al. Global cancer statistics,2012. CA Cancer J Clin,2015,65(2)：87-108.

［2］ WQ Chen,RS Zheng,PD Baade,et al. Cancer statistics in China.CA Cancer J Clin,2016,66：115-132.

［3］ Gaudiano G, Koch TH, Bello ML, et al. Lack of glutathione conjugation to adriamycin in human breast cancer MCF-7/DOX cells ： Inhibition of glutathione s -transferase p1-1 by glutathione conjugates from anthracyclines. Biochemical Pharmacology,2000,60(12)：1915.

［4］ Park YY, Jung SY, Jennings NB, et al. FOXM1 mediates Dox resistance in breast cancer by enhancing DNA repair.Carcinogenesis, 2012,33(10)：1843-53.

［5］ Patil YB, Swaminathan SK, Sadhukha T, et al. The use of nanoparticle-mediated targeted gene silencing and drug delivery to overcome tumor drug resistance. Biomaterials, 2010,31(2)：358.

［6］ 陈自强,张玮,李玉平,等.纳米载体系统逆转肿瘤及骨肉瘤多药耐药的研究进展. 药学实践杂志,2016,34(2)：103-105.

［7］ 李海燕,陈阳,何琪杨.苦参碱与粉防己碱逆转人MCF-7细胞耐药性的作用与机制.中国实验方剂学杂志,2013,19(18)：275-278.

［8］ 丘禹洪,周颉.大黄素下调ERCC1蛋白表达逆转乳腺癌化疗耐药的机制研究. 深圳中西医结合杂志,2012,22(4)：226-229.

［9］ Ross DD,Nakanishi T.Impact of breast cancer resistance protein on cancer treatment outcomes. Methods Molbiol,2010,596(6)：251-290.

［10］ Tang J,Wang Y,Wang D,et al.Key structure of Brij for overcoming multidrug resistance in cancer. Biomacromolecul es,2013,14(2)：424-430.

［11］ 齐彩霞.BCRP与P-gp在乳腺癌组织中的表达及其意义. 山西大同大学学报,2014,30(1)：52-53.

［12］ Roundhill EA, Fletcher JI, Haber M, et al. Clinical Relevance of Multidrug-Resistance-Proteins (MRPs) for Anticancer Drug Resistance and Prognosis.// Resistance to Targeted ABC Transporters in Cancer. Springer International Publishing, 2015：27-52.

［13］ Madhumita Roy,Sutapa Mukherjee.Reversal of Resistance towards Cisplatin by Curcumin in Cervical Cancer Cells. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention,2014,15(3),1403-1410.

［14］ 文思群,马梁明,鹿育晋,等.雷公藤内酯醇对伊马替尼耐药的K562/G01细胞增殖抑制及诱导凋亡作用的研究. 中国实验血液学杂志,2013,21(3)：1148-1152.

［15］ Oh SJ,Jung SP,Kim JH,et al.Silibinin inhibits TPA-induced cell migra-tion and MMP-9 expression in thyroid and breast cancer cells. Oncology Reports,2013,29(4)：1343-1348.

［16］ Akhtar R,Ali M,Mahmood S,et al.Anti-proliferative action of silibinin on human colon adenomatous cancer HT-29 cells.Nutricion Hospitalaria,2014,29(2)：388-392.

［17］ 王红军,姜媛媛,路平.水飞蓟宾的抗肿瘤、抗氧化和免疫调节分子药理学机制研究进展. 药学学报,2010,45(4)：413-421.

［18］ Kai J,Wei W,Xin J,et al.Silibinin,a natural flavonoid,induces Autophagy via ROS-dependent mitochondrial dysfunction and loss of ATP involving BNIP3 in human MCF7 breast cancer cells.Oncology Reports,2015,33(6)：2711-2718.

［19］ 周大勇,还勇为.水飞蓟宾抑制乳腺癌细胞增殖和促进其凋亡的作用及机制. 现代肿瘤医学,2016,24(6)：882-885.

［20］ Rastegar H,Ahmadi Ashtiani H,Anjarani S,et al. The role of milk thistle extract in breast carcinoma cell line(MCF-7)apoptosis with doxorubicin. Acta Med Iran,2013,51(9)：591-598.

国家自然科学基金（81473596）；浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划项目（2016R410030）；浙江省中医药科技计划（2016ZB030）

310053 浙江中医药大学第二临床医学院（吴聪冲 吴青青 喻夏昕 马芳笑）310053 浙江中医药大学基础医学院（毛丹漪 刘晓谷）*通信作者