叶荣苹 李晟 刘伟 黄智慧 陈雷 肖建新

PRKAA2基因多态性与阿托伐他汀对2型糖尿病患者降脂稳定斑块疗效的关系

叶荣苹 李晟 刘伟 黄智慧 陈雷 肖建新

目的 探讨PRKAA2基因多态性与阿托伐他汀钙在2型糖尿病伴动脉粥样硬化患者降脂稳定斑块作用的相关性。方法 2型糖尿病伴动脉粥样硬化患者203例，常规口服阿托伐他汀3个月后复查颈部B超，按照颈动脉斑块预后结果分显效组（116例）及失效组（87例），应用基因测序技术检测PRKAA2基因多态性。结果 显效组PRKAA2基因多态性（rs2796516位点）G等位基因频率显著高于失效组（64.7% vs 54.6%），显效组GG基因型显著高于失效组（39.7% vs 33.3%），差异有统计学意义（P＜0.05）。余基因型比较差异无统计学意义。结论 PRKAA2基因（rs2796516）位点与阿托伐他汀钙降脂稳定斑块的效果存在一定的相关性，单倍型模块（rs1124900-rs2796516-rs2746342-rs2051040-rs2796498-rs17848595-rs1418442）的GATCAAT单倍型对阿托伐他汀钙降脂稳定斑块的失效也存在一定作用。

腺苷酸活化蛋白激酶 基因多态性 动脉粥样硬化

Objective To explore the relevance of PRKAA2 gene polymorphism and atorvastatin in lipid-lowering to stabilize plaques in type 2 diabetes mellitus. Methods 203 cases with atherosclerosis in patients with type 2 diabetes were collected and checked neck ultrasound after 3 months of regular oral atorvastatin. They were divided into excellent group（116 cases）and failure group（87 cases）according to the prognosis of carotid plaques，detection PRKAA2 gene polymorphism was detected with the genetic sequencing technology. Results The PRKAA2 gene polymorphism（rs2796516 loci）G allele frequency in excellent group was signif i cantly higher than the failure group（64.7% vs 54.6%），GG genotype of excellent group was signif i cantly higher than the failure group（39.7% vs 33.3%），the difference was statistically signif i cant（P＜0.05）.Genotype was no statistical difference. Conclusion There is certain correlation between PRKAA2 gene（rs2796516）site with atorvastatin calcium the effect of lipid stable plaques，then haploid type module（rs1124900 - rs2796516 - rs2746342 rs2051040 - rs2796498 - rs17848595 - rs1418442）of GATCAAT haploid type of atorvastatin calcium lipid stable plaques failure also has certain effect.

AMP-activated protein kinase（AMPK） Gene polymorphism Atherosclerosis

糖尿病及动脉粥样硬化是当前严重影响人类健康的全球性公共卫生问题，其患病率逐年升高，其中我国糖尿病患病人数位居世界第二。2型糖尿病（T2DM）主要的发病机制是胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能下降。颈动脉粥样硬化是T2DM常见的大血管并发症。他汀类药物通过降低LDL-C明显降低心血管风险的作用已获公认，但个体对他汀类药的反应却不相同。国内研究证明［1］，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）可以通过增加脂肪酸氧化而减少骨骼肌中甘油三酯的合成并改善胰岛素抵抗。编码AMPKα2亚基的基因PRKAA2位于lp3。本文探讨PRKAA2基因多态性与2型糖尿病动脉粥样硬化的发病相关性。

1 临床资料

1.1 一般资料 选择2013年1月至2016年12月本院2型糖尿病伴颈动脉粥样硬化患者150例。所有患者均符合1999 年WHO 糖尿病诊断标准，颈动脉B超检查结果均符合不稳定型斑块标准。所有患者均常规口服阿托伐他汀（美国辉瑞制药有限公司）20mg口服，1次/晚，治疗3个月后，电话预约门诊随访复查颈动脉B超，转归至稳定型斑块为显效组，不稳定型斑块为失效组。排除标准：（1）近期曾出现心肌梗死及脑血管疾病。（2）既往使用降脂药物，无长期使用激素药物。（3）近期有创伤、手术或血管重建。（4）自身免疫性疾病。（5）因不能耐受药物导致严重不良反应者。（6）肝脏疾病及严重肾功能不全及恶性肿瘤。所有患者均为无血缘关系的散发人群，本项目经医院伦理委员会批准，所有患者均知情并签署同意书。

1.2 方法 （1）基因检测：于入院次日清晨空腹留取5ml静脉血提取DNA。HIF-1基因SNP的选择基因多态性的检测，从HapMap 数据库汉族人群群体中选择SNPs，基于Tagger程序选择标签SNPs，定义参数为r2≥0.80和少见等位基因频率（MAF）≥5%。最终选取代表性的SNPs位点共7个（rs1124900；rs2796516；rs2746342；rs2051040；rs2796498；rs17848595；rs1418442）。使用 primer 5.0设计引物，采用直接测序方法，读取个体的基因型。（2）颈动脉粥样硬化检测方法及诊断标准：检测颈总动脉、颈总动脉分叉处和颈内动脉起始段2. 0 cm范围内粥样硬化情况。将颈动脉内壁分为六种类型：①内膜无增厚。②内膜增厚，IMT＜1.2mm。③扁平斑。④软斑。⑤硬斑。⑥溃疡型斑。①～③属于稳定型斑块，④～⑥属于不稳定型斑块。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。分析等位基因和基因型频率与动脉粥样硬化转归的关联性。经Hardy-Weinberg平衡检验确认样本的群体代表性，基因型及等位基因频率的比较行χ2检验，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验。block根据D'＞0.9以及r2＞0.8 进行定义。频率＜3%单倍型被排除不进行统计学检验。计算各SNP间连锁不平衡程度（D'和r2）。根据可信区间算法定义单倍型块，并使用期望最大算法估算各单倍型频率。

2 结果

2.1 PRKAA2基因多态性与预后的关系 PRKAA2基因7个多态性位点的基因型分布结果见表1，两组rs2796516基因频率及基因型分布频率差异有统计学意义（P＜0.05），显效组G等位基因频率显著高于失效组（64.7% vs 54.6%），差异有统计学意义（P＜0.05），基因型分布频率比较，显效组GG基因型显著高于失效组（39.7% vs 33.3%），差异有统计学意义（P＜0.05）。余基因型比较差异无统计学意义。

2.2 连锁不平衡分析 两组均未发现连锁不平衡，见图 1、2，表 2、3。2.3 单倍体分析 在两组中定义单倍型块（rs1124900-rs2796516-rs2746342-rs2051040-rs2796498-rs17848595-rs1418442）的GATCAAT单倍型频率，失效组显著高于显效组（12.4% vs 4.9%），差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1 PRKAA2基因多位点在两组患者中的分布情况

表2 失效组Linkage Disequilibrium分析

表3 显效组Linkage Disequilibrium分析

图2 显效组Linkage Disequilibrium分析

表4 PRKAA2基因多态性单倍体分析结果

3 讨论

2型糖尿病和动脉粥样硬化是炎症、胰岛素抵抗的不同结果。炎症参与2型糖尿病和动脉粥样硬化的发生，他汀类药物可减少动脉粥样硬化所致的心脑血管事件，这可能与这些药物具有不同程度的抗炎、抗凋亡、改善胰岛素敏感性的作用有关。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated proteinki-nase，AMPK）激活后可以通过增加葡萄糖的摄取及脂肪酸的氧化，减少脂肪酸及胆固醇的合成等途径调节能量代谢，AMPK能感知细胞能量代谢状态的改变，并通过影响细胞物质代谢的多个环节维持细胞能量供求平衡。AMPK是由催化亚基α、调节亚基β和γ组成的一个异源三聚体。AMPKα2不仅在T2DM发病机制中起着重要作用，对T2DM的治疗也有重要意义。AMPKα2的激活是运动疗法的降糖作用机制之一。编码AMPKα2亚基的基因PRKAA2位于lp3，有研究［2-4］报道PRKAA2基因与T2DM及IR有关联。但在不同人群中研究结果存在差异。

前期研究［5］结果显示，rs2796516位点GG等位基因的脂联素水平高于GA及AA基因型，而抵抗素及LCL-C水平显著低于GA及AA基因型，考虑为rs2796516位点A型等位基因可以通过增加胰岛素抵抗的趋势，加速动脉粥样硬化过程。推测AMPKα2基因多态性（rs2796516）可能导致AMPK对下游蛋白激酶的磷酸化的调控，血管内皮细胞及周围组织细胞因ATP减少引起内环境的改变，并使原有的抑制能量消耗负反馈途径激活不全。从而导致血管内皮细胞的凋亡及动脉粥样硬化进展。其次也有研究提示PRKAA2基因多态性与动脉粥样硬化下游细胞因子表达中存在一定相关性［6-8］。此次研究加大样本量，观察PRKAA2基因多态性与T2DM伴颈动脉斑块患者服用阿托伐他汀降脂稳定斑块作用的关系，结果提示两组rs2796516基因频率及基因型分布频率差异有统计学意义（P＜0.05），显效组G等位基因频率显著高于失效组（64.7% vs 54.6%），显效组GG基因型显著高于失效组（39.7% vs 33.3%）。其次单倍体分析提示，单倍型模块（rs1124900-rs2796516-rs2746342-rs2051040-rs2796498-rs17848595-rs1418442）的GATCAAT单倍型频率失效组高于显效组，提示该单倍型可能与阿托伐他汀降脂稳定斑块失效存在一定相关性。

本资料结果显示，PRKAA2基因（rs2796516）位点与阿托伐他汀钙降脂稳定斑块的效果存在一定的相关性，其次单倍型模块（rs1124900-rs2796516-rs2746342-rs2051040-rs2796498-rs17848595-rs1418442）的GATCAAT单倍型对阿托伐他汀钙降脂稳定斑块的失效也存在一定作用。本研究尚存在局限性：（1）本研究样本量仍偏小，结果仍有待扩大样本量来证实。（2）由于技术原因，实验未能直接证实PRKAA2基因多态性在动脉粥样硬化发生机制。（3）本研究中患者的其他生活习惯及环境因素控制欠佳。

［1］ 刘婧星,任建功,孙保生,等.AMPKα2基因多态性与2型糖尿病及脂联素、抵抗素的关系.基础医学与临床, 2011, 3(12), 1366-1370.

［2］ Kuang X, Yan M, Ajmo JM, et al. Activation of AMP-activated protein kinase in cerebella of Atm-mice is attributable to accumulation of reactive oxygen species. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 418(2)： 267-272.

［3］ Wallace BK, Foroutan S, O'Donnell ME. Ischemia-induced stimulation of Na-K-Cl cotransport in cerebral microvascular endothelial cells involves AMP kinase. Am J Physiol Cell Physiol,2011, 301(2)： 316-326.

［4］ Venna VR, Li J, Benashski SE, et al. Preconditioning induces sustained neuroprotection by downregulation of adenosine 5-monophosphate-activated protein kinase. Neuroscience, 2012,201： 280-287.

［5］ 叶荣苹, 李晟, 施翔翔, 等. 2型糖尿病女性人群AMPKα2基因多态性与冠心病及脂联素抵抗素的关系. 浙江临床医学, 2015,17(5)： 705-707.

［6］ Wang Q, Wu S, Zhu H, et al. Deletion of PRKAA triggers mitochondrial fission by inhibiting the autophagy-dependent degradation of DNM1L. Autophagy, 2017, 13(2)： 404-422.

［7］ Di Magno L, Basile A, Coni S, et al. The energy sensor AMPK regulates Hedgehog signaling in human cells through a unique Gli1 metabolic checkpoint. Oncotarget, 2016, 7(8)： 9538-9549.

［8］ Liu L, Pan Y, Song Y, et al. Activation of AMPK α2 inhibits airway smooth muscle cells proliferation. Eur J Pharmacol, 2016,791： 235-243.

浙江省温州市科技计划项目（Y20130363）

325000 浙江温州 解放军第一一八医院