杨红+顾妍+张朝阳+孙玉东+罗德旭

摘要： 以Bonbon、嘉年华二号、先甜74、超玉4个西瓜品种为试验材料，采用辐射花粉授粉结合胚挽救技术，研究其对西瓜单倍体的诱导效果，结果表明，授粉11～12 d的西瓜果实相对较好，能得到较多的幼嫩种子；采用西瓜表面灼烧消毒再取种的方法简便易行，污染率极低。

关键词： 单倍体；辐射花粉；胚挽救；授粉；诱导效果；西瓜

中图分类号： S651.036 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）22-0159-03

γ射线是辐射花粉授粉诱导葫芦科蔬菜作物单倍体的有效辐射源。近年来，通过辐射花粉诱导雌核发育获得单倍体技术已应用于育种中，并培育出黄瓜、西瓜、甜瓜等多种葫芦科植物单倍体植株[1-3]。西瓜种子由雌花中的胚珠发育而来，一般普通种子是经授粉后双受精产生，而用辐射处理过的花粉进行授粉无法完成双受精过程而产生瘪种，及时对其进行胚挽救，可以更快得到单倍体。采用化学试剂处理可使雌花不经授粉直接膨大，形成的种子就是单倍体。本试验采用辐射花粉授粉结合胚挽救技术，探讨西瓜辐射花粉经不同胚挽救处理对坐果和单倍体胚产生的影响，为西瓜单倍体材料的获得奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2012—2014年在江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所进行，供试西瓜品种Bonbon、嘉年华二号、先甜74、超玉。Bonbon为日本引进西瓜品种，超玉为江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所育成，这2个西瓜品种的种子略大；嘉年华二号和先甜74由先正达公司提供，均为小籽西瓜品种。

1.2 试验方法

1.2.1 γ射线辐照花粉授粉对西瓜种子形成的影响 用辐射处理过的花粉进行授粉，标明花粉辐射剂量及授粉时间；授粉后8～20 d，分别采集正常生长的未成熟果实进行胚挽救试验，调查种子发育情况，同时，尝试用0.1%氯吡脲（重庆诺意）处理部分雌花，使其直接膨大，处理后8 d采集正常生长的未成熟果实进行胚挽救试验。胚挽救以MS培养基为基础添加2%蔗糖、2% D-甘露醇、7%琼脂固化，pH值为 5.8；继代培养以MS培养基为基础添加3%蔗糖、7%琼脂固化，pH值为5.8。

1.2.2 不同消毒方式对西瓜幼胚的消毒效果 将未成熟西瓜果实中的种子取出，放入灭菌烧杯中，用0.1%氯化汞（HgCl2）溶液和不同浓度次氯酸钠（NaClO）溶液分别浸泡 2～30 min（表1）；灭菌水冲洗5～6次，置于灭菌纸上吸干水分，接种于灭菌培养基上培养3～5 d，观察是否污染以确定消毒效果。

将取回的西瓜果实用75%乙醇擦拭表面，放于铁盘中，用少量的95%乙醇淋湿西瓜表面，用灼烧方法进行灭菌；无菌手术刀切开西瓜，将西瓜中的未成熟种子接种于灭菌培养基上培养3～5 d，观察是否污染以确定消毒效果。

1.2.3 不同接种方法的接种效果 试验设4个处理：切去种子远胚端约1/3后，将近胚端朝下插入培养基；切去种子远胚端约1/3后，将胚平放于培养基上；种子近胚端朝下插入培养[HJ1.4mm]基；种子平放于培养基上。接种时种子为白色或淡黄色，待种子转绿，转接至普通MS培养基上培养2～5周，种子鼓起、表皮变褐或子叶长出时去除种皮，转接至分化培养基上。

1.2.4 6-BA浓度对西瓜未成熟胚生长的影响 将消毒西瓜种子接种于含有不同浓度6-BA的培养基上培养4 d，观察并记录种子转绿过程及萌发状态。

1.2.5 西瓜种子幼胚观察及倍性鉴定 西瓜种子萌发前，对 种子幼胚进行切片观察；种子萌发至子叶展开，切取顶芽，转接入含有6-BA的MS培养基上进行增殖培养，每个品种扩繁3～4瓶；取部分芽、叶，采用醋酸洋红法进行倍性鉴定。

1.2.6 不同西瓜品种胚挽救效果 调查不同西瓜品种的胚挽救效果，对胚已萌发但未成苗进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 γ射线辐照处理对西瓜种子形成的影响

分别用授粉后8～20 d的西瓜种子进行胚挽救试验，结果表明，授粉后10 d内的西瓜种子过于幼嫩，接种时损伤较大，而授粉超过15 d的西瓜种子未成熟胚基本死亡，发育趋于成熟的又都是二倍体种子；授粉11～12 d的西瓜種子相对较好，可得到较多的幼嫩种子用于胚挽救。经氯吡脲处理的西瓜雌花，坐果率较低，但获得的可用种子数较多，而氯吡脲的效果受温度影响较大，试验效果不明显。

2.2 不同消毒方式对西瓜幼胚的消毒效果

由表1可见，各浓度的次氯酸钠溶液对西瓜幼胚的消毒效果不理想，污染率为21.1%～86.5%；随消毒时间的延长，氯化汞溶液对西瓜幼胚的消毒效果较次氯酸钠有显著提高，污染率显著降低（P<0.05）；灼烧外皮的消毒方法也相对较好，污染率较低，为2.6%。

2.3 不同接种方法的接种效果

试验表明，由于培养基中加入琼脂后具有一定的弹性，种子插入培养基后会慢慢滑出，成为平放于培养基的状态；种子插入过深，则因组培瓶内水分较大，形成无氧状态，种子迅速死亡。切去种子远胚端约1/3后接种，因组培瓶内水分较大，种子极易变黑死亡；将完整种子直接接种，在种子种皮变白或变褐、种子中间膨起或看到子叶时，将种子去除种皮进行转接，该方法接种效率相对较高，污染较少，但也会出现有部分种子因无法撑破种皮或种子内水分较高而死亡。

2.4 6-BA浓度对西瓜未成熟胚生长的影响

由表2可见，Bonbon、嘉年华二号、先甜74、超玉在6-BA浓度为5 μmol/L时的种子转绿比例相对最高，分别为44.70%、43.48%、20.11%、60.28%；种子转绿与萌发之间没有明显关系，大部分转绿的种子并没有萌发，萌发的种子大多从种皮已褐变的种子萌发而来；嘉年华二号在6-BA为 10 μmol/L 时种子萌发比例相对最高，为7.19%。endprint

2.5 西瓜种子幼胚观察及幼苗倍性鉴定

对西瓜种子幼胚进行观察发现，西瓜种子幼胚存在不同形态，由于西瓜种子相对较小，种皮较硬，在剥种子的时候极易损伤幼胚，目前得到心形胚、球形胚、子叶形胚3种形态的西瓜种子幼胚（图1）。普通二倍体西瓜的染色体为2n=22。由图2可见，组培苗根尖组织细胞内含有11条染色体，确定该组培苗材料为单倍体。

2.6 不同西瓜品种胚挽救效果及胚萌发但未成苗原因统计分析

由表3可见，嘉年华二号西瓜种子的萌发率及成苗率明显高于其他品种，而Bonbon西瓜品种的种子却没有1个萌发

成苗。由表4可见，萌发的胚没有生长点是其不能继续生长的主要原因，其异常常见为萌发后的胚异常膨大、表面布满白色绒毛等；嘉年华二号未成苗原因相对最为复杂，除胚无生长点外，还有扩繁失败及培养时玻璃化、褐化、污染、生长异常等现象发生。

3 结论与讨论

试验结果表明，以辐射花粉授粉11～12 d的西瓜果实相

对较好，可得到较多的幼嫩种子，且西瓜果实须当天采当天用，否则无论是室温还是低温条件下储存，都不能保证试验材料的鲜活。目前，已知成功获得西瓜的单倍体植株是由花药培养或胚珠培养[4-7]得来，其消毒方法均采用药剂消毒。本试验发现，西瓜未成熟种子的胚较幼嫩，种皮很薄，用试剂消毒对西瓜未成熟种子损伤较大，且消毒不彻底；完好的西瓜幼瓜内部近似于无菌状态，采用75%乙醇浸泡并灼烧外皮法消毒并取种，其污染率极低。由于花粉辐射受环境限制较大，本试验尝试用氯吡脲处理西瓜，使其不经授粉直接膨大，其幼胚一旦萌发得到的便是单倍体，但采用氯吡脲处理西瓜雌花坐果率较低，接种数千粒种子仅得到几个单倍体材料，加上其过于娇嫩，未能获得加倍材料。氯吡脲处理西瓜并进行胚挽救，获得西瓜单倍体的方法只需静待其萌发，前期处理和接种工作量相对较大，但筛选工作量大大减少。

适用于葫芦科作物的培养基配方多不适于西瓜，而在基础MS培养基中适当增加盐酸硫胺素含量有助于西瓜的生长。西瓜幼嫩种子在含有5～10 μmol/L 6-BA、添加2%蔗糖和2%甘露醇的MS培养基上生长3～7 d，转至无6-BA而添加2～3%蔗糖、1～2%甘露醇的MS培养基上继续生长（添加6-BA含量会影响种子生长）而产生愈伤组织；待西瓜种子的子叶长出可在含有1～10 μmol/L 6-BA、添加3%蔗糖的MS培养基上进行增殖（6-BA 1 μmol/L和5 μmol/L交替使用可防止玻璃化苗的出现），在含有5 μmol/L IBA、添加3%蔗糖的1/2 MS培养基上进行生根培养。吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）不适用于西瓜单倍体培养，而在培养基中加入0.1%～0.2%的活性炭可能够促进其生长。

Ertan等对南瓜种子的幼胚进行观察，得出8种形态的南瓜种子幼胚，且认为球形胚和心形胚能够培养得到的是单倍体材料，子叶形胚培养得到的是二倍体材料，而其他形态的胚则无法正常发育[8]。本试验结果表明，西瓜种子球形胚经培养得到的是单倍体材料，子叶形胚得到的是二倍体材料，而其他形态的胚则没有发育。

参考文献：

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[8]Kurtar E S，Balkaya A. Production of in vitro haploid plants from in situ induced haploid embryos in winter squash （Cucurbita maxima Duchesne ex Lam.） via irradiated pollen[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2010，102（3）：267-277.endprint