吴思婧+曹瑞霞+吴能表

摘要：以半夏[Pinellia ternate（Thunb.） Breit]愈伤组织为材料，研究不同外源添加物对半夏愈伤组织内GOGAT、GDH、GOT、PAL活性和总生物碱、鸟苷和腺苷含量的影响。结果表明，不同浓度的外源添加物SNP、ASA、Phe、Asp单一或两两复合添加，均能提高半夏愈伤组织中GOGAT、GDH、GOT、PAL的活性，增加总生物碱和鸟苷的含量。其中，1 mg/L ASA和150 mg/L Asp复合处理诱导GOGAT、GDH、GOT、PAL活性提高和可溶性蛋白含量增加的效果最好，此时半夏愈伤组织中总生物碱及鸟苷含量分别比对照增加131.0%、146.7%。适宜浓度的SNP、ASA、Phe、Asp可通过提高半夏愈伤组织中GOGAT、GDH、GOT、PAL活性加速无机氮的同化及转化效率，促进总生物碱、鸟苷和腺苷的合成与积累。

关键词：半夏[Pinellia ternate（Thunb.） Breit]；愈伤组织；外源添加物；次生代谢；总生物碱；鸟苷；腺苷

中图分类号：S567.23+9.1-33 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）22-4323-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.22.029

Abstract： By using Pinellia ternate（Thunb.） Breit callus as materials，the effects of exogenous additives on the activities of several secondary metabolism key enzymes and the contents of total alkaloids， guanosine and adenosine were studied. The result shows，the result showed that exogenous additives enhanced the activities of GOGAT，GDH，GOT，PAL and increased the contents of total alk alkaloids and guanosine of P. ternate callus in different concentration treatments， of which 1 mg/L ASA and 150 mg/L Asp incorporated promoted the activities of GOGAT，GDH，GOT and PAL，and was best which increased soluble protein content，increased alkaloids and guanosine contents by 131.0% and 146.7% than of CK，respectively.appropriate concentration of SNP，ASA，Phe，Asp enhanced GOCAT，GDH，GOT and PAL activity in callus，which accelerated the assimilation and conversion efficiency of inorganic nitrogen and furnish more precursor of secondary metabolism. Furthermore，the contents and accumulation of alkaloids， guanosine and adenosine increased correspondingly.

Key words： Pinellia ternate（Thunb.） Breit； callus； exogenous additives； secondary metabolism； total alkaloids； guanosine； adenosine

半夏[Pinellia ternate（Thunb.）Breit]是中國传统中药材之一，药用历史悠久，市场需求量大。近年来，因其在镇咳、止呕、降脂、抗肿瘤、抗病毒、基因治疗等方面的应用深入[1，2]而格外受到关注，所以提高半夏中次生代谢物质的产量对推动半夏的深度开发意义重大。

氮代谢是植物体内重要的代谢途径，它不仅影响着植物的新陈代谢、资源分配、各形态发育，还影响着植物次生代谢产物的生成[3]。罗建平等[4]认为，激发子能诱导细胞结构发生积极变化，以利于次生代谢产物的形成、运输和积累；郭肖红等[5]认为，诱导子可经过信号传导途径刺激细胞中特定的酶并改变其活力，从而影响该酶催化的代谢途径中反应速率和代谢通量，引起次生代谢物质产量的改变；Xu等[6]发现介导真菌诱导子诱发粉葛细胞中葛根素和体内SA生物合成所必需的上游信号分子是NO。同时，与氮代谢密切相关的谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、谷氨酸脱氨酶（GDH）、谷草转氨酶（GOT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等关键酶已在农作物、水果、林业、药用植物等多种植物研究中受到广泛关注[7-9]，但在植物次生代谢途径的调控中，诱导子是否会引起GOGAT，GDH、GOT、PAL等氮代谢关键酶的变化目前的研究还不多见。试验以半夏愈伤组织为材料，通过单一或两两复合添加适宜浓度的外源物苯丙氨酸（Phe）、天冬氨酸（Asp）、硝普钠（SNP）、乙酰水杨酸（ASA）于培养基中，从氮代谢角度探讨其对半夏愈伤组织中总生物碱、鸟苷和腺苷的调控机理，为Phe、Asp、SNP、ASA调控半夏愈伤组织中次生代谢的通路研究打下理论基础，为提高半夏愈伤组织中总生物碱、鸟苷和腺苷含量提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

以半夏幼嫩叶柄为外植体，参照曹瑞霞等[10]的方法诱导半夏愈伤组织，其继代培养基为MS+2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L IAA。选取培养了5代且生长均一、旺盛的半夏愈伤组织，分别接入添加如下外源物的11种培养基中（11个处理），分别是0 mg/L （CK）、50 mg/L Phe （T1）、150 mg/L Asp （T2）、1 mg/L SNP （T3）、1 mg/L ASA （T4）、50 mg/L Phe+150 mg/L Asp（T5）、50 mg/L Phe+1 mg/L ASA（T6）、150 mg/L Asp+1 mg/L ASA（T7）、1 mg/L SNP+1 mg/L ASA（T8）、50 mg/L Phe+1 mg/L SNP（T9）、1 mg/L SNP+150 mg/L Asp（T10），其中T1～T4是添加单一外源物处理，T5～T10是不同外源物两两复合处理。每个平板中接入4块愈伤组织，每个处理10个平板，于光照培养箱中培养，培养条件为黑暗、（25±1） ℃、12 h/d，30 d后取出愈伤组织进行各项指标的测定，每个指标重复3次。

1.2 方法

1.2.1 愈伤组织相对生长速率的测定 培养30 d后取出愈伤组织，洗去培养基后用吸水纸吸干水分称其鲜重，并计算半夏愈伤的相对生长速率。

相对生长速率=（收获鲜重-接种鲜重）/接种鲜重。

1.2.2 酶活性测定 参照Zhao等[11]的方法提取酶液，略有改动。精密称取1 g培养30 d的各处理半夏愈伤组织，放于研钵中，共加8 mL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（含2 mmol/L MgSO4、0.5 mmol/L EDTA、10 mmol/L β-巯基乙醇，pH 8.0），冰浴研磨，然后于4 ℃，10 000 r/min离心30 min，上清液用于有关酶活性的测定。其中GOGAT活性的测定参考王小纯等[12]的方法，GDH活性的测定参照Loulakakis等[13]的方法，GOT活性的测定参照莫良玉等[14]的方法，PAL活性的测定参照孙健玲[15]的方法；以每分钟增加0.01个OD值为一个酶活性单位（U）。

1.2.3 有关成分含量测定 采用考马斯亮蓝G250比色法[16]测定半夏愈伤组织中的可溶性蛋白含量，采用紫外分光光度法[17]测定半夏愈伤组织中的总生物碱含量。鸟苷和腺苷含量的测定采用HPLC分析法[10]，鸟苷保留时间约为5.5 min，腺苷保留时间约为10 min，色谱峰分离情况见图1。

2 结果与分析

2.1 外源添加物对半夏愈伤组织生长的影响

不同的外源添加物对半夏愈伤组织相对生长速率的影响情况见图2。由图2可知，在单独添加適宜浓度外源物的处理（T1～T4）中，T2、T3、T4处理的半夏愈伤组织相对生长速率均增加，但T1处理的半夏愈伤组织相对生长速率比对照减少24%；不同外源物两两复合添加处理（T5～T10）对半夏愈伤组织的生长速率均具有促进作用，以T10处理（1 mg/L SNP+150 mg/L Asp）的促进效果最好，其相对生长速率达3.273，比对照增加131.0%。

2.2 外源添加物对半夏愈伤组织中GOGAT活性的影响

植物的氮代谢包括无机氮的还原、同化及有机含氮化合物的转化、合成等生化过程[14]，GS/GOGAT偶联形成的循环是高等植物体内氮同化的主要途径，在无机氮转化为有机氮的过程中起关键作用，而GOGAT是此循环中的关键酶[18]；不同的外源添加物对半夏愈伤组织中GOGAT活性的影响情况见图3。由图3可知，单独添加Phe、Asp、SNP、ASA（T1-T4） 均有利于半夏愈伤组织中GOGAT活性的提高，分别比对照增加了57.1%、20.8%、78.0%、62.7%；将Phe、Asp、SNP、ASA两两复合加入半夏愈伤组织培养基中（T5-T10），则T5、T6、T7、T9处理增加了GOGAT的活性，且T7比对照增加了111.1%。

2.3 外源添加物对半夏愈伤组织中GDH活性的影响

在植物体内的GDH可催化谷氨酸脱氨，生成的NH4+进入GS/GOGAT循环再利用，因此GDH有辅助GS/GOGAT循环的作用[19，20]，在植物的新陈代谢中占有非常重要的地位；不同的外源添加物对半夏愈伤组织中GDH活性的影响情况见图4。由图4可知，单独添加Phe、Asp、SNP、ASA（T1～T4）的处理均能诱导GDH活性增加，以T3处理的增加最明显，比对照增加了77.4%；当Phe、Asp、SNP、ASA两两复合添加后，T5～T10处理均可使半夏愈伤组织中的GDH活性提高。综合比较T1～T10处理后发现，T7和T9处理最有利于半夏愈伤组织中GDH活性的提高，分别比对照增加87.4%、83.8%。

2.4 外源添加物对半夏愈伤组织中GOT活性的影响

GOT是一种转氨酶，在植物的氮代谢过程中占有非常重要的地位。GS/GOGAT途径和GDH/GOGAT途径合成的谷氨酸在GOT作用下，可将氨基可逆地转移到草酰乙酸的羰基上形成天冬氨酸和α-酮戊二酸，天冬氨酸是半夏总生物碱和鸟苷、腺苷合成的底物，其活性受底物谷氨酸含量的影响；不同的外源添加物对半夏愈伤组织中GOT活性的影响情况见图5。由图5可知，在T1～T4处理中，T4处理的GOT活性升高最多，比对照增加52.0%，T3、T1、T2处理次之，分别比对照增加了42.4%、40.0%、39.2%。对于T5～T10处理而言，T5，T6，T7，T8，T9处理均促进了GOT活性的提高，且T7处理（1 mg/L ASA+150 mg/L Asp）的效果最好，比对照增加106.3%；但T10处理比对照降低了50.0%。

2.5 外源添加物对半夏愈伤组织中PAL活性的影响

PAL是连接植物初生代谢与次生代谢的重要酶，可将苯丙氨酸转化成反式肉桂酸，进一步生成苯甲醛，再在天冬氨酸、甘氨酸协同作用下合成麻黄碱。其活性易受到病原菌感染、低温、光照、机械损伤、毒素及昆虫取食等多种外界因素的影响[21]；不同的外源添加物对半夏愈伤组织中PAL活性的影响情况见图6。由图6可知，在T1～T4处理中，T1、T3处理的活性较高，分别是对照的126.9%，128.9%。当Phe，Asp，SNP，ASA两两复合添加到半夏愈伤组织培养基处理（T5～T10）后，除T10处理抑制PAL活性外，其他各处理均提高了PAL活性，其中T7处理增加幅度最大，比对照增加63.9%。

2.6 外源添加物对半夏愈伤组织中可溶性蛋白含量的影响

蛋白质是植物体内有机物代谢强弱的主要生理指标[22]，其中可溶性蛋白大多数是参与各种代谢的酶类及底物，所以可溶性蛋白含量可作为反映植物总代谢的一个重要指标；不同的外源添加物对半夏愈伤组织中可溶性蛋白含量的影响情况见图7。由图7可知，半夏愈伤组织中的可溶性蛋白含量均有增加，其中T7处理比对照提高107.9%，增幅最大。

2.7 外源添加物对半夏愈伤组织中次生代谢产物含量的影响

不同的外源添加物对半夏愈伤组织中次生代谢产物含量的影响情况见表1。从表1可见。T7处理的半夏愈伤组织中总生物碱和鸟苷的含量与对照相比增加幅度大，最高含量分别比对照提高了131.0%、146.7%，腺苷含量却大大低于对照；其中T10处理则抑制了半夏愈伤组织中的总生物碱和腺苷的积累，分别比对照降低了1.8%、71.4%，鸟苷含量则高于对照1倍。

3 小结与讨论

3.1 前体物Asp和Phe对半夏愈伤组织中氮代谢和次生代谢物合成的影响

试验中添加Asp和Phe对半夏愈伤组织内GOGAT、GDH、GOT、PAL活性及可溶性蛋白、总生物碱、鸟苷、腺苷含量均产生了影响。有研究指出，氨基酸进入植物体内后，可通过转氨基、脱氨基作用及其他过程加以同化[23]。向半夏愈伤组织培养基中分别添加适宜浓度的Phe（T1）、Asp（T2）后，发现半夏愈伤组织的GOGAT、GDH、GOT活性明显高于对照，说明半夏可能通过调节这些酶来适应氨基酸环境。当半夏吸收氨基酸态氮之后，一方面通过GOT转氨酶形成其他氨基酸、合成蛋白质及核酸等含氮类化合物；另一方面通过GDH脱氨基形成NAD（P）H，为体内的生命活动及次生代谢提供能量。GOT转氨酶作用和GDH脱氨基作用均形成α-酮戊二酸，而α-酮戊二酸为多种碳氮代谢提供碳架结构[24]，还可参与三羧酸循环提供能量[25]。PAL是一种诱导酶，试验中PAL活性多数处理显著高于对照，可能是Phe、Asp刺激了半夏愈伤组织中PAL酶基因的表达，增加了PAL的数量及活性。而且添加了Phe（T1）、Asp（T2）处理的半夏愈伤组织中可溶性蛋白含量要高于对照，说明Phe、Asp的添加增加了半夏愈伤组织内的酶数量及游离氨基酸含量，提高了半夏新陈代谢效率。

3.2 诱导子SNP和ASA对半夏愈傷组织中氮代谢和次生代谢产物合成的影响

一氧化氮（NO）作为一个重要的信号分子参与植物体内多种生理过程的调节。SNP调控植物氮代谢的研究已有报道，如张少颖等[26]发现外源NO浸种能促进玉米（Zea mays L.）幼苗叶片NR活性的提高；焦娟[27]研究表明，添加SNP可缓解NO3-胁迫中NR、GS、GDH等酶活性的降低。试验发现，向半夏愈伤组织培养基中添加SNP后，其体内GOGAT、GDH、GOT等酶活性显著高于对照，可能是NO提高了细胞中NR活性[28]、将植物吸收的NO3-还原成NH4+、细胞中NH4+的增多又促使GOGAT和GDH以及GOT等活性增加、加速无机氮向有机氮同化及转化造成的。另一方面，NO可诱导PAL基因表达，提高PAL活性[29]，适宜浓度SNP的添加显著提高了半夏愈伤组织中PAL活性，这与胡向阳等[30]的结果一致。由此可知，SNP可能通过提高植物氮代谢及次生代谢相关酶活性来提高半夏愈伤组织中总生物碱、鸟苷和腺苷的含量。郝岗平等[31]在研究银杏（Ginkgo biloba L.）悬浮细胞的黄酮类物质生成时发现，NO可能通过触发银杏悬浮细胞的防卫反应，激活细胞中黄酮类物质的生物合成途径。但对于NO是否在半夏愈伤组织中触发其防卫反应，通过氮、碳代谢共同作用引起次生代谢物含量的提高，还有待于下一步试验证实。

ASA是SA的衍生物，在植物体内可调节多种生理过程[32，33]。有研究表明，外源添加物ASA可提高植物体内SA水平，并通过SA的生理效应实现其生理功能[34]。试验发现，添加适宜浓度的ASA提高了半夏愈伤组织中GOGAT、GDH、GOT活性及可溶性蛋白含量，可能是因为SA诱导了半夏中NR的mRNA积累、促使NR活性的提高所致[35]；也有可能是SA同时提高了氮还原动力NR活性及氮同化动力泵GS活性，加之转氨酶活性[36]，从而加速了无机氮的吸收、同化及转运，合成游离氨基酸及可溶性蛋白，并产生能量，这些物质均为半夏愈伤组织中总生物碱、鸟苷及腺苷合成提供了底物及能量。试验结果表明，ASA的添加提高了半夏愈伤组织中PAL活性，可能是SA诱导了PAL基因的表达缘故[37]。研究发现，添加诱导子ASA后，GOGAT、GDH、GOT、PAL活性与总生物碱、鸟苷、腺苷含量呈一定的正相关，说明ASA可能通过提高氮代谢及次生代谢相关酶的活性，直接或间接提供半夏愈伤组织中总生物碱、鸟苷和腺苷合成所需的底物及能量，从而来提高半夏愈伤组织中总生物碱、鸟苷和腺苷的含量。

3.3 外源物复合添加对半夏愈伤组织中氮代谢和次生代谢产物合成的影响

当Phe、Asp、SNP、ASA两两复合加入时，发现诱导子与前体物复合添加均提高了半夏体内GOGAT、GDH、GOT、PAL活性及可溶性蛋白含量，其中以ASA与Asp复合（T7）的效果最好，可能是前体物的加入为半夏氮代谢及次生代谢提供了底物，而诱导子进一步提高了GOGAT、GDH、GOT等氮代谢酶及PAL活性，加速了无机氮的同化及转化，为半夏愈伤组织中总生物碱、鸟苷及腺苷积累提供了更多的底物及能量。SNP与ASA复合却抑制了各酶的活性及次生代谢物的合成，可能是因为二者浓度不合适或者没有协同作用，也可能是加入的时间不合适，其原因有待下一步比较。

总之，适宜浓度的SNP、ASA、Phe、Asp可通过提高半夏愈伤组织中的GOGAT、GDH、GOT、PAL活性，加速无机氮的同化及转化效率来促进总生物碱、鸟苷和腺苷的合成与积累。

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