低温臭氧处理对草莓灰霉菌和枯萎菌的抑制活性及其品质的影响

2017-12-25王振华蔡万伦尚吟竹

湖北农业科学 2017年22期

王振华+蔡万伦+尚吟竹

摘要：以臭氧作为熏蒸剂，在4 ℃低温条件下设置不同剂量（10、20、40 mg/L）处理2 h，对草莓上灰霉病菌（Botrytis cinerea）、枯萎病菌（Fusarium oxysporum）进行室内抑制效果测定。在同样温度下，以25 mg/L的臭氧剂量熏蒸2 h，对储藏不同时间（0、4、8、16 d）的草莓进行品质（硬度、可溶性固形物含量、维生素C及总酸度）测定。结果表明，随着处理浓度的提高，臭氧处理后的草莓烂果率分别为9.23%、3.33%、1.28%（枯萎病）和10.92%、4.17%、0.83%（灰霉病），均极显著低于相应的对照处理（35.99%、32.82%）。4种草莓的硬度随储藏时间延长变化不显著，臭氧处理与对照间差异也不显著；臭氧熏蒸后4种草莓的可溶性固形物含量、维生素C含量、总酸度在储藏16 d后均极显著高于对应品种的对照；烂果率极显著低于对照。

关键词：臭氧；熏蒸活性；灰霉病菌（Botrytis cinerea）；枯萎病菌（Fusarium oxysporum）；品质

中图分类号：S432.4+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）22-4309-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.22.025

Abstract： At 4 ℃， the two-hours fumigant was conducted at the dose of 10，20，40 mg/L for assessing the impact of ozone on Fusarium oxysporum and Botrytis cinerea from strawberry field， and the quality of strawberry （hardness，soluble solids content（SSC），VC content and titratable acid（TA）） was figured out at the 0，4，8，16-days storage after the two-hours fumigant by the 25 mg/L of ozone. Results showed that the decay rates of strawberry on the ozone treatment were 9.23%，3.33%，1.28%（Fusarium oxysporum，on the order of dose），and 10.92%，4.17%，0.83%（Fusarium oxysporum），and these were significant lower than those on the control（35.99% and 32.82%，respectively）. After the two-hours fumigant，the hardness of strawberry had no significant difference between ozone treatments and the control by the storage time going. However，the VC，SSC，TA of the strawberry on the treatment were higher than those on the control，but the decay rate on the ozone treatment was significantly lower.

Key words： ozone； fumigant toxicity； Botrytis cinerea； Fusarium oxysporum； quality

草莓枯萎病与灰霉病是草莓生产中的常见病害。其中灰霉病属于低温高湿型病害，病原菌为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），其生长温度在2～30 ℃，当温度为20～25 ℃、湿度持续保持90%以上时高发[1]。能侵染叶、花、果、茎，侵染果实时能导致10%～50%的减产[2]。由于是气传病害，很难将其彻底在种植区域内根治。草莓枯萎病的病原是尖孢镰刀菌草莓专化型（Fusarium oxysporum Schlecht. f. sp. fragariae Winks et Williams），草莓枯萎病菌主要侵害根部，在苗期症状不明显，主要表现在开花期至收获期。目前已成为草莓种植区主要土传病害之一。发病率在10%～35%。染病草莓轻者结果少，品质差，重者枯死绝收[3，4]。由于两种病害在防治上均属于难以根治的类型，导致防治往往陷入长期使用大量化学农药的恶性循环和杀菌剂抗性增长[5，6]。因此，近年来，研究者多从植物源或者生物源去寻找替代物进行防治[7-9]。

臭氧是一种具有极高氧化性的化学物质，很早就被人类用来进行食品保鲜，消毒杀菌处理[10，11]。臭氧近年来也被研究者引入草莓保鲜冷藏领域，并且获得了成功[12，13]。但是，尚少见以检疫处理为目的，在综合考虑各种草莓有害生物（病害）基础上，开展相应的臭氧熏蒸研究。本研究以臭氧和低溫为两种处理因子，探讨其对常见草莓病害枯萎病与灰霉病的熏蒸活性，以期在草莓进出口贸易中建立一种高效的替代溴甲烷熏蒸的检疫处理技术。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

通风厨，武汉新天第实验设备有限公司；控温冷柜（-2～10 ℃）、GSP医药专用柜，浙江华美冰箱有限公司；臭氧发生器（SOZ-30C型），SPRING；手持式臭氧检测仪（0～5 000 mg/L，PN-5000-EX），深圳市鹏雷科技有限公司；1 L气体采集袋（Tedlar？誖（泰德拉）PVF气体采样袋），大连海得科技有限公司；1 L自制气体熏蒸瓶：网购1 L带橡胶塞广口玻璃瓶，在橡胶塞上圆心处钻出一个直径8 mm的孔，插入一根直径8 mm长10 cm的玻璃管即为出气孔或进气孔；5 L自制气体熏蒸箱：网购5 L塑料整理箱，在盖上通过钻孔安装上2个进气阀门（取自上述气体采样袋上的阀门），一个用于散气，另一个用于充气；直径4 mm或8 mm的硅胶管，二通阀、三通阀若干；温湿度计、计时器、200 mL注射器各一个；UV752型紫外-可见分光光度计，上海奥谱勒仪器有限公司；PAL-1数显手持糖度仪，ATAGO（爱宕）中国分公司。FT02型果实硬度计，邢台润联科技开发有限公司；PE整理箱，5 L容积，购自当地市场。

试剂（NaOH、Cu（NO3）2、HCl、草酸）均为分析纯，购自国药集团。

1.2 供试材料

由湖北省农业科学院经济作物研究所提供草莓灰霉病菌、枯萎病菌的菌悬液，浓度为106 CFU/mL。使用时，用无菌水稀释10倍使用。

供试鲜果品种为法兰地、红颜、晶玉、晶瑶，从湖北省农业科学院经济作物研究所草莓基地采摘8成熟大小一致的完好鲜果（长约4 cm，果径3 cm），利用冷藏盒尽量保证不受损，运回实验室。采摘24 h内进行各项研究。

1.3 方法

1.3.1 低温臭氧熏蒸处理对草莓枯萎病菌、灰霉病菌的抑制活性参照乔彩云[11]的方法，制备1.2 mg/L的臭氧水，将采摘回的鲜果浸泡于臭氧水进行表面消毒5 min，然后平铺于带有吸水纸的白瓷盘上（白磁盘38 cm×25 cm，约50个），整体置于超净工作台晾干60 min，以备熏蒸使用。

分别用装有20 mL的106 CFU/mL灰霉病菌或枯萎病菌菌悬液微型喷雾器对白瓷盘中的草莓果喷雾，使20 mL菌悬液均匀分布于各个草莓果上。室温晾干30 min。然后每5个置于一个1 L自制的熏蒸瓶中。充入适量体积的标准臭氧气体，分别获得10、20、40 mg/L臭氧熏蒸浓度。然后置于2 ℃冰柜中熏蒸2 h。熏蒸结束后，拿出熏蒸瓶散气5 min，敞口继续置于冰柜中冷藏保存，10 d后检查烂果数目，果实上存在1个烂（霉）斑，且直径超过0.1 cm即为烂果。以喷过菌悬液未做熏蒸处理的草莓果作为空白对照。每一批次每个浓度重复6个熏蒸瓶，重复试验3个批次。

1.3.2 低温臭氧熏蒸对草莓品质的影响以后续品质参数测定所需鲜果数为计算依据，确定熏蒸处理的每个品种所需总果数（每种约10×3×4，其中10个为一个熏蒸重复，重复3次，4个抽样时间）。

在预试验基础上，以5 L整理箱为熏蒸容器，确定获得25 mg/L浓度的标准臭氧通气时间。然后进行正式2 h熏蒸试验。即将4个品种草莓果每种10个共40个为一组置于整理箱中，充入25 mg/L的标准臭氧气体，置于4 ℃冰柜中熏蒸2 h，散气10 min，后继续放入冰柜中冷藏即为一个重复，重复12组，冷藏0、4、8、16 d，分别随机取3个熏蒸箱的果实进行品质鉴定。冷藏结束时，统计最终时刻各个处理的烂果率。

用FT02型果实硬度计测量，取草莓切开，测量其赤道部位的硬度，每次取10个果实进行测定。测完的果实研磨出果浆，用于下面各个参数的测定。可溶性固形物用PAL-1手持糖度计测定；参照刘艳芳等[14]的方法，利用紫外分光光度计进行维生素C含量测定；可滴定酸含量测定参照陈屏昭等[15]的方法。果实TA以柠檬酸计，迅速称取10.0 g果浆转移到100 mL容量瓶中，用无菌水定容至刻度，摇匀，静置30 min后过滤，用标定的0.1 mol/L的NaOH进行滴定，滴定至溶液初显粉红色并在0.5 min内不褪色为终点（pH约8.2）。

1.4 数据处理

合并每个批次同一个处理的6个熏蒸瓶烂果数，烂果率即为总烂果数/总处理果数（5×6=30）×100%，共3个批次试验，即每个处理最后得到3次烂果率的重复数据。利用SPSS 14软件，对不同浓度臭氧熏蒸处理的烂果率及品质参数分别进行单因素方差分析，利用Turkey法在0.05水平上检验差异显著性。

2 结果与分析

由表1可知，不同处理间的烂果率差异极显著（枯萎病菌：F3，12=1 531.10，P<0.000 1；灰霉病菌：F3，12=86.27，P<0.000 1）。病原菌导致的烂果率随着臭氧处理浓度的提高迅速降低，当臭氧浓度达到40 mg/L时，2种病原菌导致的烂果率在1.5%以下，对应的不处理对照在30%左右。

25 mg/L臭氧处理后，不同储藏时间下4种（法兰地、红颜、晶玉、晶瑶）草莓果的硬度变化动态见图1。由图1可以看出，臭氧熏蒸与对照处理的4种草莓果随着储藏时间的延长，果实硬度均呈下降趋势，从储藏4 d后，果实硬度又开始上升。但臭氧熏蒸后16 d，4个品种草莓果的硬度均与对应品种的对照处理差异不显著。

25 mg/L臭氧处理后，不同储藏时间下4种（法兰地、红颜、晶玉、晶瑶）草莓果的可溶性固形物含量变化动态见图2。由图2可以看出，臭氧熏蒸与对照处理的4种草莓果随着储藏时间的延长，果实可溶性固形物含量总体呈下降趋势。但臭氧熏蒸后16 d，4种草莓果的可溶性固形物含量均极显著高于对应品种的对照处理（依次为：F1，4=7.73，29.57，17.56， 14.12；P=0.05，0.01，0.01，0.02），表明臭氧能显著延緩果实可溶性固形物下降的趋势。

25 mg/L臭氧处理后，不同储藏时间下4种（法兰地、红颜、晶玉、晶瑶）草莓果的维生素C含量变化动态见图3。由图3可以看出，臭氧熏蒸与对照处理的4种草莓果随着储藏时间的延长，果实维生素C含量总体呈下降趋势，8 d前维生素C含量变动极小，8 d后开始迅速下降。但臭氧熏蒸后16 d，4种草莓果的维生素C含量均极显著高于对应品种的对照处理（依次为：F1，4=55.65，102.33，267.17，50.95； P=0.00，0.00，0.00，0.00），表明臭氧能显著延缓草莓果中维生素C含量下降的趋势。

25 mg/L臭氧处理后，不同储藏时间下4种（法兰地、红颜、晶玉、晶瑶）草莓果中可滴定酸含量变化见图4。从图4可以看出，臭氧熏蒸与对照处理的4个品种草莓果随着储藏时间的延长，可滴定酸含量整体呈下降趋势。但臭氧熏蒸后16 d，4种草莓果中可滴定酸含量均极显著高于对应品种的对照处理（依次为F1，4=17.78，8.34，42.25，0.78；P=0.01，0.04，

0.00，0.43），表明臭氧能显著延缓草莓果中可滴定酸含量下降的趋势。

经臭氧处理后，储藏16 d的草莓果，不仅品质参数下降得到极大延缓，而且还显著降低了草莓果的烂果率（F1，4=687.02，2 054.96，648.11，1 468.21；P<0.000 1）。由表2可以看出，4种草莓果经4 ℃下25 mg/L臭氧处理后，储藏16 d的最高烂果率不超过2.1%，极显著低于对应的对照组50%以上的烂果率，表明臭氧处理能极大延缓草莓品质劣变的趋势。

3 讨论

臭氧杀灭微生物的机理是作用于细胞膜，致细胞膜的通透性增加，胞内物质外流而使细胞失去活性，破坏细胞质内的遗传物质使其失去功能。因此，从接触臭氧分子直接程度而言，较高等生物（如昆虫）比微生物更加耐受臭氧[10]。近些年的臭氧保鲜研究表明，臭氧在21 mg/m3时就能很好抑制烂果的发生[13]。本研究的最高处理浓度40 mg/L相当于90 mg/m3，其对草莓常见病原抑制效果达到96%以上。结合草莓上害虫熏蒸活性研究来看，要达到检疫处理的效果，使用臭氧工作浓度将远高于本研究所使用的臭氧浓度，故未来考虑建立草莓进境检疫熏蒸技术规程时，应优先考虑杀灭昆虫而不是病原微生物。

草莓采收后的经济价值直接与其储藏品质相关，其硬度、可溶性固形物、维生素C、可滴定酸含量是衡量果实品质最直接参数。一般而言，鲜草莓的货架期在7 d左右，随着储藏时间的延长，各项品质参数会迅速下降[12，13]。本研究结果表明，4 ℃低温储藏，即使不做任何处理，前期（8 d以前）各项品质参数变动都非常小（图1-图4），8 d后各项品质参数下降幅度将迅速提高，而经高浓度（25 mg/L）臭氧处理后，则极显著降低了品质劣变的速率，使储藏超出正常草莓货架期2倍时，还能保证烂果率不高于2.1%，表明臭氧结合低温联合处理非常适合处理草莓，能有效延长草莓果的储藏时间，提高效益。

参考文献：

[1] 郁国芳，郑莉，毛程亮，等.草莓灰霉病發生规律及无公害防治技术[J].上海农业科技，2006（1）：122-123.

[2] 邬若兰.湖南省保护地草莓灰霉病（Botrytis cinerea）的发生、防治情况调查及控制药剂的筛选研究[D].长沙：湖南农业大学，2013.

[3] 于红梅，赵密珍，王静，等.草莓枯萎病菌的分离、鉴定及生物学特性[J].江苏农业科学，2013，41（11）：124-127.

[4] 曾富春.草莓枯萎病病原鉴定、生物学特性、病害循环及防治研究[D].四川雅安：四川农业大学，2006.

[5] 顾春波，史晓斌，姜莉莉，等.草莓枯萎病菌对多菌灵的抗性及其抗性菌株生物学特性[J].植物保护学报，2010，37（3）：266-272.

[6] 张从宇，黄剑鹏，王荣华.番茄灰霉病菌对速克灵的抗性检测[J].安徽农业科学，2004，32（2）：310-311.

[7] 李娜.草莓灰霉病菌生防细菌的筛选及其抗菌机制的研究[D].济南：山东师范大学，2010.

[8] 段丹萍，乔勇进，鲁莉莎，等.香樟叶提取物对草莓灰霉病菌的抑制效果及保护酶活性的影响[J].湖北农业科学，2011，50（4）：723-727.

[9] 袁坤，吴光旭，郭春玲，等.艾蒿提取物对草莓灰霉菌的抗菌活性研究[J].安徽农学通报，2006，12（13）：55-56.

[10] 付晓记，祝水兰，林勇敢，等.粮油原料贮藏前臭氧预杀虫灭菌技术研究[J].农产品加工（学刊），2013（6）：76-78.

[11] 乔彩云.臭氧水对红富士苹果贮藏品质及其杀菌效果的研究与应用[D].西安：陕西师范大学，2012.