殷 燕,殷 董,任晓阳,任牡丹,董 蕾,和水祥(西安交通大学第一附属医院消化内科,西安 7006;陕西省人民医院皮肤科;西安交通大学第二附属医院消化内科;通讯作者,E-mail:hesx@6.com)

Urocortin1通过CRF受体2介导激活肠神经系统抑制小肠转运功能

殷 燕1,殷 董2,任晓阳1,任牡丹1,董 蕾3,和水祥1*
(1西安交通大学第一附属医院消化内科,西安 710061;2陕西省人民医院皮肤科;3西安交通大学第二附属医院消化内科;*通讯作者,E-mail:hesx123@126.com)

目的 探讨urocortin1是否通过CRF受体2激活肠神经系统调控小肠转运功能。 方法 82只雄性6-8周龄SD大鼠,随机分为iv urocortin1组,静脉注射10 μg/kg urocortin1;盐水对照组,静脉注射生理盐水0.3 ml;ip astressin2-B+iv urocortin1组,腹腔注射astressin2-B(300 μg/kg),间隔1 h,静脉注射urocortin1(10 μg/kg);ip astressin2-B组,腹腔注射astressin2-B(300 μg/kg),间隔1 h,静脉注射生理盐水0.3 ml;icv astressin2-B+iv urocortin1组,侧脑室注射astressin2-B(300 μg/kg),间隔1 h,静脉注射urocortin1(10 μg/kg);icv astressin2-B组,侧脑室注射astressin2-B(300 μg/kg),间隔1 h,静脉注射生理盐水0.3 ml;正常大鼠组,无干预措施。采用埃文斯蓝含量测定法检测小肠转运功能(small intestinal transit,SIT),采用几何中心表示;采用免疫组化方法检测肠神经系统和中枢神经系统c-Fos表达;采用免疫荧光组化方法检测肠神经系统CRF受体2的表达。 结果 与盐水对照组相比,iv urocortin1组SIT减慢,中枢神经系统核团和肠神经系统c-Fos表达增加,差异具有统计学意义(P<0.05);与iv urocortin1组相比,ip astressin2-B+iv urocortin1组SIT增快,肠神经系统c-Fos表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05),但中枢神经系统c-Fos表达仅轻度降低,差异无统计学意义(P>0.05);与iv urocortin1组相比,icv astressin2-B+iv urocortin1组SIT和中枢神经系统c-Fos表达无显著改变,差异无统计学意义(P>0.05);正常大鼠胃、十二指肠、空肠和回肠肠神经系统中可检测到CRF受体2表达。 结论 Urocortin1通过CRF受体2介导激活肠神经系统抑制了小肠转运功能。

urocortin1; CRF受体2; 小肠转运; c-Fos; 肠神经系统

Urocortin1是促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropin releasing factor,CRF)家族成员,在调节胃肠运动、内脏敏感性、情绪行为和应激反应中具有重要作用[1-3]。与CRF类似,urocortin1广泛分布于中枢神经系统,接受机体应激信号,介导应激所致的胃肠运动功能紊乱[4]。进一步研究发现,urocortin1在胃肠道黏膜、黏膜下及肌间神经丛中也有分布,在外周水平同样具有调控胃排空、小肠消化间期活动和结肠蠕动的作用,而该作用主要是通过与CRF受体结合实现[5]。CRF受体主要包括CRF受体1和CRF受体2(CRF receptor 2,CRF-R2),其中CRF-R2与urocortin1分布具有一定的重叠性,前期研究已证实urocortin1通过CRF-R2介导抑制胃排空,阻断了小肠消化间期复合肌电活动[6],那么urocortin1是否能够调控小肠转运功能(small intestinal transit,SIT),外周或中枢水平CRF-R2是否参与其中?肠神经系统(enteric nervous system,ENS)是调节控制胃肠道功能的独立整合系统,通过感觉神经元、中间神经元和运动神经元间的化学突触,启动或抑制肌肉组织的收缩活动从而调控肠道蠕动[7],而CRF-R2在小肠绒毛、固有层和肠神经元、神经纤维中均有少量表达,因此urocortin1是否通过CRF-R2介导激活肠神经系统从而调控小肠转运功能是本研究所关注的焦点。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

Urocortin1、astressin2-B和c-Fos抗体购自美国Sigma公司,CRF-R2和PGP9.5抗体购自美国Abcam公司,荧光显微镜系日本Olympus公司BX51,图像信号采集与分析系统系德国LEICA公司Qwin550Cw。

1.2 实验动物

清洁级封闭群SD雄性大鼠82只,6-8周龄,体质量(200±50)g,购自西安交通大学医学院动物中心,实验动物生产许可证号SCXK(陕)2012-003。所有大鼠单笼饲养,环境温度为20-25 ℃,相对湿度50%-70%,12 h光照-黑暗时间交替,自由进食、饮水,按照实验动物使用的3R原则给予人道关怀,所有操作措施得到西安交通大学动物伦理委员会许可。将实验大鼠随机分为iv urocortin1组(n=12),静脉注射urocortin1(10 μg/kg);盐水对照组(n=12),静脉注射生理盐水0.3 ml;ip astressin2-B+iv urocortin1组(n=12),腹腔注射astressin2-B(300 μg/kg),间隔1 h,静脉注射urocortin1(10 μg/kg);ip astressin2-B组(n=12),腹腔注射astressin2-B(300 μg/kg),间隔1 h,静脉注射生理盐水0.3 ml;icv astressin2-B+iv urocortin1组(n=12),侧脑室注射astressin2-B(300 μg/kg),间隔1 h,静脉注射urocortin1(10 μg/kg);icv astressin2-B组(n=12),侧脑室注射astressin2-B(300 μg/kg),间隔1 h,静脉注射生理盐水0.3 ml;正常大鼠组(n=10),无干预措施。

1.3 侧脑室套管置入术

大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后,固定于脑立体定位仪上,按照Paxinos和Watson脑立体定位图谱,将套管针置入左侧侧脑室,以牙科水泥和牙托粉固定外套管,左侧侧脑室坐标:前囟后0.8-1.0 mm,正中线左侧1.3-1.5 mm,颅骨表面下4.0-4.3 mm。术后第6天,icv astressin2-B+iv urocortin1组大鼠侧脑室注射astressin2-B(300 μg/kg,5 μl),间隔1 h,静脉注射urocortin1(10 μg/kg,0.3 ml);icv astressin2-B组大鼠侧脑室注射astressin2-B(300 μg/kg,5 μl),间隔1 h,静脉注射生理盐水0.3 ml。实验结束后,侧脑室推入2%滂胺天蓝确定套管针位置,侧脑室壁染为蓝色认为套管针位置准确。

1.4 小肠转运功能检测

采用埃文斯蓝含量测定法[8]检测小肠转运功能,除正常组大鼠外,其余各组大鼠(每组6只)禁食不禁水48 h,给予各种干预措施后,间隔1 h,采用埃文斯蓝灌胃,间隔30 min,腹腔注射10%水合氯醛麻醉脱颈处死,将小肠取出,被分为长度相等的10段,置入0.1 mol/L NaOH 25 ml中,超声波浴1 h,静置1 h,4 ℃,3 000 r/min离心20 min,弃去沉淀,保留上清液,蒸馏水稀释后波长565 nm检测吸光度(A)。小肠转运功能采用几何中心表示(geometric center,GC):小肠转运=Σ分段A/总段A×数段。

1.5 免疫组化法检测胃肠道和中枢神经系统c-Fos表达

除正常组大鼠外,其余各组大鼠(每组6只),给予各种干预措施后,间隔1 h,腹腔注射10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,获取大鼠脑、十二指肠(幽门远端2 cm)、空肠(屈氏韧带远端2 cm)和回肠(盲肠近端2 cm),4%多聚甲醛固定8 h,25%蔗糖溶液4 ℃过夜,用冰冻切片机进行脑连续冠状切片,片厚40 μm,肠道连续切片,片厚10 μm,采用SP免疫组织化学染色,切片经PBS漂洗,Trition X-100孵育,血清封闭,加入兔抗c-Fos抗体孵育48 h,PBS漂洗,加生物素标记二抗4 ℃孵育过夜,辣根酶标记链酶卵白素工作液孵育40 min,DAB显色。

下丘脑室旁核(paraventricular hypothalamic nucleus,PVN)选取平面:前囟后1.56-2.04 mm;中央杏仁核(central nucleus of the amygdale,CeA)选取平面:前囟后1.8-2.4 mm;臂旁核(parabrachial nucleus,PBN)选取平面:前囟后9.16-9.68 mm;蓝斑(loucscoeruleus,LC)选取平面:前囟后9.48-10.04 mm;孤束核(nucleus tractus solitaries,NTS)选取平面:前囟后13.24-13.8 mm;延髓最后区(area postrema,AP)选取平面:前囟后13.68-14.08 mm。每个动物选取核团典型平面2-4个,单侧计数,取该动物此区域的c-Fos阳性神经元平均数。肠道切片c-Fos阳性神经元利用QWIN分析软件进行灰度分析。

1.6 免疫荧光双标法检测胃肠道CRF-R2表达

正常组大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,获取大鼠胃、十二指肠(幽门远端2 cm)、空肠(屈氏韧带远端2 cm)和回肠(盲肠近端2 cm),4%多聚甲醛固定8 h,25%蔗糖溶液4 ℃过夜。将固定脱水后的胃肠道剪切成5 mm×5 mm方块,制作胃肠道肌间神经丛铺片,PBS漂洗,Trition X-100孵育,血清封闭,加兔抗CRF-R2抗体和小鼠抗PGP9.5抗体,4 ℃过夜,PBS漂洗,加FITC驴抗兔和AlexaFluor 594驴抗小鼠抗体,4 ℃过夜,避光,PBS漂洗,荧光显微镜观察。

1.7 统计学分析

结果以均数±标准误表示,采用SPSS13.0软件分析数据,多组间比较采用方差分析中的Student-Newman-Keuls检验,两组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 腹腔注射astressin2-B拮抗静脉注射urocortin 1引起的小肠转运的抑制

与盐水对照组大鼠相比,iv urocortin1组大鼠小肠转运功能显著减慢(6.12±0.33vs4.21±0.30),差异具有统计学意义(P<0.05)。给予CRF-R2特异性拮抗剂astressin2-B(300 μg/kg)干预,与iv urocortin1组相比,ip astressin2-B+iv urocortin1组大鼠小肠转运功能显著增快(4.21±0.30vs5.92±0.55),差异具有统计学意义(P<0.05),而icv astressin2-B+iv urocortin1组大鼠小肠转运功能无明显改变(4.21±0.30vs4.56±0.61),差异无统计学意义(P>0.05,见图1)。

与盐水组比较,*P<0.05;与iv urocortin1组比较,#P<0.05图1 各组大鼠小肠转运功能检测Figure 1 The SIT function in different groups

2.2 腹腔注射astressin2-B拮抗静脉注射urocortin 1引起的肠神经系统c-Fos阳性神经元表达

盐水对照组大鼠十二指肠、空肠、回肠肌间神经丛和黏膜下神经丛仅有少量c-Fos表达,与对照组相比,iv urocortin1组大鼠十二指肠、空肠、回肠肌间神经丛和黏膜下神经丛c-Fos表达显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。腹腔注射astressin2-B(300 μg/kg)可以拮抗静脉注射urocortin1引起的肠神经系统中c-Fos表达,与iv urocortin1组相比,ip astressin2-B+iv urocortin1组大鼠十二指肠、空肠、回肠肌间神经丛和黏膜下神经丛c-Fos表达显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。单纯腹腔注射astressin2-B(300 μg/kg)仅能引起小肠ENS中少量c-Fos表达,与盐水对照组相比差异无统计学意义(P>0.05,见表1,图2)。

表1Astressin2-B可以拮抗urocortin1引起的肠神经系统c-Fos表达

Table1Astressin2-Bantagonizedtheexpressionofc-FosinENSinducedbyurocortin1

组别 十二指肠 空肠 回肠 盐水组36 85±6 1314 13±4 5818 41±2 94 ivurocortin1组88 82±20 39∗44 82±9 71∗43 22±11 83∗ ipastressin2-B+ivurocortin1组42 19±14 41#32 42±6 98#27 82±7 36# ipastressin2-B组37 89±5 3515 51±2 6522 56±4 35

与盐水组比较,*P<0.05;与iv urocortin1组比较,#P<0.05

A1、B1、C1为iv urocortin1肠神经系统c-Fos表达,A2、B2、C2为ip astressin2-B+iv urocortin1肠神经系统c-Fos表达图2 各组大鼠肠神经系统c-Fos表达 (×200)Figure 2 The expression of c-Fos in ENS in different groups (×200)

2.3 腹腔注射或侧脑室注射astressin2-B不能拮抗静脉注射urocortin1引起的中枢核团c-Fos阳性神经元表达

iv urocortin1组大鼠中枢多个核团包括PVN、CeA、PBN、LC、NTS和延髓AP核团可检测到c-Fos阳性神经元表达(见图3),而盐水对照组仅能引起相应核团少量c-Fos阳性神经元表达,两组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。腹腔注射astressin2-B(300 μg/kg)或侧脑室注射astressin2-B(300 μg/kg)无法拮抗静脉注射urocortin1引起的中枢神经核团c-Fos阳性神经元表达,即与iv urocortin1组相比,ip astressin2-B+iv urocortin1组和icv astressin2-B+iv urocortin1组中枢多个核团c-Fos阳性神经元表达差异无统计学意义(P>0.05,见表2)。

图3 静脉注射urocortin1可以引起中枢神经系统不同核团c-Fos表达 (×200)Figure 3 Intravenous injection of urocortin1induced the expression of c-Fos at nucleus of CNS (×200)

表2Astressin2-B无法拮抗ivurocortin1引起的中枢神经系统c-Fos表达

Table2Astressin2-Bdidnotantagonizetheexpressionofc-FosatCNSinducedbyintravenousurocortin1

组别PVN CeA PBNLCNTSAP盐水组 32 67±13 8520 67±9 0710 60±6 774 40±1 6715．00±5 9414．00±4 36ivurocortin1组106 25±23 65∗44 29±14 80∗34 83±21 41∗9 94±4 19∗35 74±12 37∗33 60±5 59∗ipastressin2-B+ivurocortin1组100 50±21 2840 25±6 5031 86±18 337 29±2 8728 25±6 5828 67±17 55icvastressin2-B+ivurocortin1组102 12±15 9543 11±4 8924 85±6 388 74±1 7226 80±3 5128 34±7 21

与盐水组比较,*P<0.05

2.4 胃肠道肠神经系统中CRF-R2表达

荧光显微镜观察到大鼠胃、十二指肠、空肠和回肠肌间神经丛均可见亮绿色的CRF-R2免疫反应阳性神经元和神经纤维。在肌间神经丛神经节内可观察到CRF-R2免疫反应阳性神经元细胞聚集分布,胞体成圆形或椭圆形,胞质染色,胞核不着色。CRF-R2免疫反应阳性神经纤维呈串珠样结构,与纵肌层肌纤维平行排列,也可不规则交联成网状。免疫荧光双标显示CRF-R2免疫反应阳性神经元和神经纤维和PGP9.5免疫反应阳性神经元和神经纤维基本重叠,说明CRF-R2存在于肠神经系统神经元和神经纤维中(见图4)。

图4 CRF-R2在大鼠胃、十二指肠、空肠和回肠肠神经系统的表达Figure 4 Expression of CRF-R2 at gastric, duodenal,jejunal and ileal small intestinal ENS

3 讨论

Urocortin1是参与调节胃肠运动、内脏敏感性、慢性黏膜炎症和摄食行为的一种脑肠肽。Urocortin1可以明显抑制大鼠胃固体食物排空[9],减少餐后胃窦收缩,阻断胃和小肠消化间期MMC发生,促进结肠转运,促进排便和增加结肠肌电活动[10],该作用分别是通过CRF-R2与CRF-R1介导而实现的[11]。既往研究采用原位杂交、RT-PCR以及免疫组化等技术检测到CRF-R2散在分布于中枢神经系统以及胃、小肠和结肠黏膜上皮层、巨噬细胞、黏膜下血管周围、黏膜下和肌间神经丛[12,13],然而CRF-R2在ENS中的形态学研究较少。肠神经系统是存在于胃肠壁内的一个完整的神经网络,具有多种功能神经元,在中枢神经系统、自主神经以及脑肠肽、神经递质等相互作用下,通过协调胃肠道兴奋性和抑制性神经元促进或抑制胃肠道平滑肌收缩调节胃肠运动。在本研究利用神经元标记物PGP9.5,采用免疫荧光双标技术证实大鼠胃、十二指肠、空肠和回肠肌间神经元和神经纤维均可见不同程度的CRF-R2的表达,为CRF-R2的激活可能直接作用于ENS从而调控胃肠运动提供形态学上的证据。

CRF受体属于G蛋白偶联受体,在原代培养的肠神经元中,CRF通过CRF受体促进细胞外信号调节激酶磷酸化从而激活肠神经元[14];电生理学研究进一步发现urocortin1可以引起结肠肠神经系统AH Ⅱ型和SI型肠神经元去极化,增强兴奋性,urocortin 2/3可以通过CRF-R1和CRF-R2介导引起AH Ⅱ型肠神经元去极化[5],提示urocortins可能通过肠神经系统激活直接调控胃肠道运动。本研究中静脉注射urocortin1明显抑制了小肠转运功能,腹腔注射CRF-R2激动剂astressin2-B可以阻断urocortin1的抑制作用,而中枢注射astressin2-B无法阻断urocortin1对小肠转运的抑制作用。本研究进一步显示,urocortin1抑制小肠转运功能同时可激活肠神经系统,且腹腔注射CRF-R2拮抗剂在阻断了urocortin1效应时也降低了肠神经系统c-Fos的表达,提示urocortin1通过外周CRF-R2介导激活肠神经系统而发挥抑制小肠运动的调控作用。

在本研究中,静脉注射urocortin1除了激活小肠肠神经系统外,还可以激活中枢神经系统核团包括PVN、CeA、PBN、LC、NTS以及AP等核团。PVN、CeA、LC是中枢神经系统中直接与胃肠运动调节相关的神经核团,研究发现PVN微量注射CRF可以引起胃排空减慢,但同时加速结肠转运,促进排便,且这种反应呈剂量相关性,而脂肪因子Apelin通过促进PVN CRF表达而调控应激引起的胃结肠动力异常[15];杏仁核内微量注射缩胆囊素可抑制应激和CRF引起的结肠高动力,电刺激内侧区可增加胃动力指数[16];而蓝斑核微量注射CRF可以加快结肠转运和促进排便[17]。PBN、NTS和AP核团之间与PVN、杏仁中央核等具有复杂的双向神经纤维投射,可以通过间接信号传递或直接调控副交感神经系统影响胃肠道运动。生理情况下外周循环中的urocortin1难以通过血脑屏障进入脑中,然而由于AP缺乏正常的血脑屏障,对蛋白质具有一定的通透性。因此,推测外周urocortin1可能通过与AP的接触将体液信息转换为神经信息,继而通过与孤束核、下丘脑的纤维投射,逐级将神经信号传至中枢,激活中枢核团。那么中枢核团激活是否参与了外周urocortin1对小肠运动的调控呢,进一步研究显示腹腔注射CRF-R2拮抗剂能够拮抗静脉注射urocortin1引起的肠神经系统c-Fos表达,但不能拮抗urocortin1对中枢神经系统核团的激活,而中枢给予CRF-R2拮抗剂亦不能拮抗urocortin1对中枢神经系统核团的激活,提示静脉注射urocortin1主要是通过外周CRF-R2的介导激活肠神经系统调控小肠转运功能。

综上所述,CRF-R2分布于大鼠胃十二指肠和空回肠肌间神经元和神经纤维中,静脉注射urocortin1通过外周CRF-R2介导激活肠神经系统,而非中枢神经系统,从而抑制小肠转运功能。

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Urocortin1inhibitssmallintestinaltransitbyactivationofentericnervoussystemviaCRFreceptor2

YIN Yan1,YIN Dong2,REN Xiaoyang1,REN Mudan1,DONG Lei3,HE Shuixiang1*
(1DepartmentofGastroenterology,FirstAffiliatedHospitalofXianJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;2DepartmentofDermatology,ShaanxiProvincalPeople’sHospital;3DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:hesx123@126.com)

ObjectiveTo explore whether intravenous injection of urocortin1 could regulate the small bowel transit(SIT) function by activating the corticotropin releasing factor receptor 2(CRF-R2) in the enteric nervous system(ENS).MethodsEighty-two male 6-8-week-old SD rats were randomly divided into intravenous(iv) urocortin1 group(10 μg/kg), saline control group(iv injection of 0.3 ml normal saline); intraperitoneal(ip) astressin2-B+iv urocortin1 group(ip injection of astressin2-B at 300 μg/kg, and iv injection of urocortin1 at 10 μg/kg after the interval of 1 h), ip astressin2-B group(ip injection of astressin2-B at 300 μg/kg, and iv injection of 0.3 ml normal saline after the interval of 1 h), intracerebroventricular(icv) astressin2-B+iv urocortin1 group(icv injection of 300 μg/kg astressin2-B, and iv injection of 10 μg/kg urocortin1 after the interval of 1 h), icv astressin2-B group(icv injection of astressin2-B at 300 μg/kg, and iv injection of 0.3 ml normal saline after the interval of 1 h), normal group(no intervention). SIT function was detected by Evans blue using the calculation of geometric center. Expression of c-Fos in the ENS and central nervous system(CNS) was detected by immunohistochemical method. Expression of CRF-R2 was detected by immunofluorescence method.ResultsCompared with saline control group, SIT function was slowed and the expression of c-Fos was increased in CNS and ENS in iv urocortin1 group(P<0.05). Compared with iv urocortin1 group, the SIT function increased and the expression of c-Fos in ENS decreased in ip astressin2-B+iv urocortin1 group, and the difference was statistically significant(P<0.05), however, the expression of c-Fos in CNS showed no statistical difference between the two groups(P>0.05). Compared with iv urocortin1 group, the SIT function and expression of c-Fos in CNS in icv astressin2-B+iv urocortin1 group had no statistical difference(P>0.05). In normal group, the CRF receptor 2 expression was detected at the gastric, duodenal, jejunal and ileal ENS.ConclusionUrocortin1 may inhibit SIT function by activating ENS via CRF receptor 2.

urocortin1; corticotropin releasing factor receptor 2; small intestinal transit; c-Fos; enteric nervous system

中央高校基本科研业务费专项资金资助(2015gjhz22)

殷燕,女,1979-07生,博士,主治医师,E-mail:doctoryinyan@126.com

2017-09-18

R333.3

A

1007-6611(2017)12-1249-07

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.12.011