原姗姗,张彦亭,张 欣,左利平,庄 坤,唐海灵(西安交通大学附属西安市中心医院消化内科,西安 710003;通讯作者,E-mail:xasthl@163.com)

miR-655-3p对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

原姗姗,张彦亭,张 欣,左利平,庄 坤,唐海灵*
(西安交通大学附属西安市中心医院消化内科,西安 710003;*通讯作者,E-mail:xasthl@163.com)

目的 探讨miR-655-3p对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。 方法 采用qRT-PCR检测miR-655-3p在GES-1、MKN-28、SGC-7901和BGC-823细胞系中的表达水平;qRT-PCR证实转染agomiR-655-3p后miR-655-3p的过表达水平;MTT实验检测过表达miR-655-3p对胃癌细胞增殖的影响;Transwell实验检测过表达miR-655-3p对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。 结果 与GES-1细胞相比,miR-655-3p在MKN-28、SGC-7901和BGC-823细胞系中的表达均降低(P<0.05),其中低分化的BGC-823细胞系表达最低;转染agomiR-655-3p将BGC-823细胞中成熟miR-655-3p的表达水平提高了35.3倍(P<0.05);过表达miR-655-3p可抑制BGC-823细胞增殖(P<0.05);过表达miR-655-3p降低了BGC-823细胞的迁移和侵袭能力,每个视野迁移细胞数由223±15降低至117±9(P<0.05),侵袭细胞数由124±14降低至61±6(P<0.05)。 结论 过表达miR-655-3p可抑制BGC-823胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

胃癌; miR-655-3p; 细胞增殖; 细胞迁移; 细胞侵袭

胃癌是全球第四大最常见的恶性肿瘤,其分布具有明显的地域特征,中国、日本、韩国等东亚国家属于胃癌高发国家。胃癌的病因包括幽门螺杆菌感染、饮食习惯、遗传因素等。国际癌症研究机构(IARC)统计数据表明,2008年全球胃癌新发病例98.9万,占所有癌症新发病例的7.8%,仅次于肺癌、乳腺癌、结直肠癌[1]。

微小RNA(microRNA,miRNA)属于单链非编码RNA分子,长度仅为18-24个核苷酸,能够和特定mRNA的3′端非翻译区结合,导致mRNA的降解或蛋白翻译受阻,从而抑制基因表达。一个miRNA分子可调控多个mRNA的表达,而一个mRNA也可受多个miRNA分子的调控,从而形成了复杂的调控网络。miRNA广泛参与了多种细胞生物学过程,如细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化等。大量研究证实,miRNA既可以作为抑癌基因,又可以作为癌基因,其异常表达与肿瘤的形成和发展密切相关[2]。已有研究表明miR-655-3p具有抑制肿瘤的作用,但尚未有其与胃癌相关性的研究报道[3]。本研究旨在初步探讨miR-655-3p对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

1 材料和方法

1.1 主要仪器

CO2细胞培养箱(Thermo,美国);超净工作台(苏州真田洁净有限公司);正置荧光显微镜(Olympus,日本);台式低温离心机(Eppendorf,德国);NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop Tech,美国);ABI 7500 Fast实时定量PCR仪(Applied Biosystems,美国);iMark酶标仪(Bio-Rad,美国)。

1.2 主要试剂

DMEM高糖细胞培养基(上海联硕生物科技有限公司);胎牛血清(上海玉博生物科技有限公司);TRIzol、Lipofectamine 2000脂质体(Invitrogen,美国);SYBR Premix Ex Taq聚合酶、One Step PrimeScript®miRNA cDNA合成试剂盒(TaKaRa,日本);MTT细胞增殖检测试剂盒、结晶紫染色液(上海碧云天生物技术有限公司);Matrigel基质胶(BD Bioscience,美国)。

1.3 细胞培养

人永生化胃黏膜上皮细胞系GES-1及3种人胃癌细胞系MKN-28(高度分化)、SGC-7901(中度分化)、BGC-823(低度分化)均由西安市中心医院消化内科保存。采用含10%胎牛血清的DMEM于CO2细胞培养箱中常规培养,待细胞生长至对数生长期,胰酶消化,收集细胞用于实验。

1.4 RNA提取及实时定量PCR(qRT-PCR)

TRIzol法提取总RNA,用ND-1000分光光度计进行核酸定量,采用One Step PrimeScript®miRNA cDNA合成试剂盒进行逆转录反应,以SYBR Premix Ex Taq聚合酶进行qRT-PCR,反应条件为:95 ℃ 30 s预变性,95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s两步法进行40个循环。miR-655-3p的上游引物为5′-CCG CGA TAA TAC ATG GTT AAC CTC-3′,下游引物为Uni-miR qPCR通用引物,内参U6上游引物为5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′,下游引物为5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′[4]。

1.5 寡核苷酸细胞转染

miR-655-3p激动剂(agomiR-655-3p)和阴性对照(negative control,NC)购自上海吉玛制药技术有限公司,agomiR-655-3p正义链序列为5′-AUA AUA CAU GGU UAA CCU CUU U-3′,反义链序列为5′-AGA GGU UAA CCA UGU AUU AUU U-3′,阴性对照正义链序列为5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′,反义链序列为5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′。应用Lipofectamine 2000脂质体进行寡核苷酸细胞转染,具体步骤按说明书操作。

1.6 MTT实验检测细胞增殖

收集寡核苷酸转染后的细胞,以2×103个细胞/孔的密度接种96孔板,分别在培养0,1,2,3,4 d时,向培养孔中加入MTT溶液,继续培养4 h,弃上清后每孔加入150 μl的DMSO以溶解甲臜颗粒,应用iMark酶标仪检测490 nm处的吸光度(OD490)。

1.7 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭

采用Transwell chamber进行细胞迁移和侵袭实验。寡核苷酸转染细胞后培养48 h,消化收集细胞,调整细胞密度为2×105个/ml,向Transwell上室中加入200 μl细胞悬液,下室中加入500 μl含15%胎牛血清的DMEM,培养24 h,取出Transwell,刮去滤膜表面细胞,迁移至滤膜背面的细胞以4%多聚甲醛固定后进行结晶紫染色,光学显微镜下计数迁移细胞。对于细胞侵袭实验,需预先采用Matrigel基质胶包被Transwell滤膜,细胞接种后需培养48 h,其余步骤与迁移实验相同。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 miR-655-3p在胃癌细胞系中的表达

为分析比较miR-655-3p在胃癌细胞系中的表达,以永生化胃黏膜上皮细胞系GES-1为对照,采用qRT-PCR检测了3种不同分化程度胃癌细胞系中miR-655-3p的表达水平,结果表明:与GES-1细胞相比,miR-655-3p在高度分化的MKN-28胃癌细胞中表达较高,在中度分化的SGC-7901胃癌细胞中表达次之,在低度分化的BGC-823胃癌细胞中表达最低(P<0.05,见图1)。

2.2 转染agomiR-655-3p后miR-655-3p的过表达水平检测

将agomiR-655-3p寡核苷酸转染BGC-823胃癌细胞后,采用qRT-PCR对转染效果进行鉴定,结果表明:与阴性对照(NC)组比较,转染agomiR-655-3p显著提高了BGC-823细胞中成熟miR-655-3p的表达水平,是对照组的35.3倍(P<0.05,见图2)。

与GES-1细胞比较,*P<0.05图1 miR-655-3p在胃癌细胞系中的表达Figure 1 Expression of miR-655-3p in gastric cancer cell lines

与阴性对照(NC)组比较,*P<0.05图2 过表达miR-655-3p的效果鉴定Figure 2 Identification of miR-655-3p overexpression

2.3 过表达miR-655-3p对BGC-823胃癌细胞增殖的影响

将agomiR-655-3p寡核苷酸转染BGC-823胃癌细胞后,采用MTT法检测过表达miR-655-3p对细胞增殖的影响,结果表明:与阴性对照(NC)组比较,agomiR-655-3p明显抑制了BGC-823细胞增殖(P<0.05,见图3)。

2.4 过表达miR-655-3p对BGC-823胃癌细胞迁移的影响

将agomiR-655-3p寡核苷酸转染BGC-823胃癌细胞后,应用Transwell检测过表达miR-655-3p对细胞迁移能力的影响,结果表明:与阴性对照(NC)组比较,过表达miR-655-3p具有降低BGC-823细胞迁移能力的作用,每个视野迁移细胞数由223±15降低至117±9(P<0.05,见图4)。

2.5 过表达miR-655-3p对BGC-823胃癌细胞侵袭的影响

将agomiR-655-3p寡核苷酸转染BGC-823胃癌细胞后,用Transwell检测过表达miR-655-3p对细胞侵袭能力的影响,结果表明:与阴性对照(NC)组比较,过表达miR-655-3p显著抑制了BGC-823细胞的侵袭能力,每个视野侵袭细胞数由124±14降低至61±6(P<0.05,见图5)。

与阴性对照(NC)组比较,*P<0.05图3 过表达miR-655-3p对胃癌细胞增殖的影响Figure 3 Effect of miR-655-3p overexpression on gastric cancer cell proliferation

与阴性对照(NC)组比较,*P<0.05图4 过表达miR-655-3p对胃癌细胞迁移的影响Figure 4 Effect of miR-655-3p overexpression on gastric cancer cell migration

与阴性对照(NC)组比较,*P<0.05图5 过表达miR-655-3p对胃癌细胞侵袭的影响Figure 5 Effect of miR-655-3p overexpression on gastric cancer cell invasion

3 讨论

许多研究已证实miRNA与胃癌的分化程度、肿瘤大小、转移状况、幽门螺杆菌感染等各种临床特征及预后紧密关联,其中既包括促癌miRNA的表达增高,如miR-17、mir-19a、miR-20a、miR-21、miR-25、miR-27a、miR-106a、miR-106b、miR-200b、miR-215、miR-222等,又包括抑癌miRNA的表达降低,如let-7a、miR-143、miR-148a、miR-200c、miR-204、miR-218、miR-433等[5]。

目前,有关miR-655-3p的研究报道较少[3,4]。已知miR-655-3p基因定位于染色体14q32,该位点已鉴定出4个miRNA分子,除miR-655-3p外还包括miR-127-5p、miR-369-3p和miR-544a。采用乳腺癌肺转移模型证实miR-127-5p、miR-544a和miR-655-3p能够通过靶向转移生长因子β受体2(TGFBR2)和Rho关联卷曲螺旋蛋白激酶2(ROCK2)而抑制肿瘤细胞的黏附、侵袭和转移[6]。miR-655-3p在肝癌组织和细胞中表达明显降低,与肿瘤大小、门静脉癌栓形成、TNM分期、肿瘤转移等显著相关,过表达miR-655-3p能够靶向解整合素样金属蛋白酶10(ADAM10)而抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭[4]。此外,肝癌组织中miR-655-3p的表达水平与患者生存期相关,是肝癌预后的独立危险因素[7]。在肝癌细胞中证实ATP结合盒转运体G2(ABCG2)是miR-655-3p的靶分子,而ABCG2是介导肿瘤多药耐药性的重要蛋白,这提示miR-655-3p与肿瘤耐药性相关[8]。

综上所述,现有的研究进展证实miR-655-3p属于抑癌miRNA分子。据此,本研究检测了miR-655-3p在永生化胃黏膜上皮细胞系GES-1和3种不同分化程度胃癌细胞系中的表达水平,结果表明,随着胃癌细胞系的分化程度下降,miR-655-3p的表达水平也不断降低,这提示miR-655-3p的表达水平与胃癌细胞的分化程度之间具有正相关关系。随后以miR-655-3p表达水平最低的BGC-823胃癌细胞系为模型,证实过表达miR-655-3p能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。本研究结果表明miR-655-3p具有抑制胃癌细胞恶性表型的作用,其体内抑癌作用和相关分子机制有待下一步研究。

[1] Ang TL, Fock KM. Clinical epidemiology of gastric cancer[J]. Singapore Med J, 2014, 55(12):621-628.

[2] Wang QX, Zhu YQ, Zhang H,etal. Altered MiRNA expression in gastric cancer: a systematic review and meta-analysis[J]. Cell Physiol Biochem, 2015, 35(3):933-944.

[3] Chang P, Wang X, Zhou Y,etal. Analysis of the correlation between the expression of miR-655 and esophageal cancer prognosis[J]. Oncol Lett, 2017, 13(6):4691-4694.

[4] Wu G, Zheng K, Xia S,etal. MicroRNA-655-3p functions as a tumor suppressor by regulating ADAM10 and β-catenin pathway in Hepatocellular Carcinoma[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2016, 35(1):89.

[5] da Silva Oliveira KC, Thomaz Araújo TM, Albuquerque CI,etal. Role of miRNAs and their potential to be useful as diagnostic and prognostic biomarkers in gastric cancer[J]. World J Gastroenterol, 2016, 22(35):7951-7962.

[6] Uppal A, Wightman SC, Mallon S,etal. 14q32-encoded microRNAs mediate an oligometastatic phenotype[J]. Oncotarget, 2015, 6(6):3540-3552.

[7] Zhao XQ, Liang B, Jiang K,etal. Down-regulation of miR-655-3p predicts worse clinical outcome in patients suffering from hepatocellular carcinoma[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2017, 21(4):748-752.

[8] Awortwe C, Kaehler M, Rosenkranz B,etal. MicroRNA-655-3p regulatesEchinaceapurpureamediated activation of ABCG2[J]. Xenobiotica, 2017:Epub ahead of print.

EffectsofmiR-655-3pongastriccancercellproliferation,migrationandinvasion

YUAN Shanshan,ZHANG Yanting,ZHANG Xin,ZUO Liping,ZHUANG Kun,TANG Hailing*
(DepartmentofGastroenterology,Xi’anCentralHospital,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710003,China;*Correspondingauthor,E-mail:xasthl@163.com)

ObjectiveTo investigate the effects of miR-655-3p on proliferation, migration and invasion of gastric cancer cells.MethodsThe expression levels of miR-655-3p in GES-1, MKN-28, SGC-7901 and BGC-823 cell lines were detected by qRT-PCR. After transfection of agomiR-655-3p, overexpression of miR-655-3p was verified by qRT-PCR. The effect of miR-655-3p overexpression on gastric cancer cell proliferation was detected by MTT assay. The effects of miR-655-3p overexpression on gastric cancer cell migration and invasion were detected by Transwell assay.ResultsThe expression of miR-655-3p decreased in MKN-28, SGC-7901 and BGC-823 cell lines compared to that in GES-1 cell line(P<0.05),and the lowest in poorly differentiated BGC-823 cell line. The expression level of mature miR-655-3p in BGC-823 cells increased by 35.3 times after transfection of agomiR-655-3p(P<0.05). The BGC-823 cell proliferation was inhibited by miR-655-3p overexpression(P<0.05). The BGC-823 cell migration and invasion were decreased by miR-655-3p overexpression. Migration cells per field decreased from 223±15 to 117±9(P<0.05), and invasion cells per field decreased from 124±14 to 61±6(P<0.05).ConclusionOverexpression of miR-655-3p can inhibit BGC-823 gastric cancer cell proliferation, migration and invasion.

gastric cancer; miR-655-3p; cell proliferation; cell migration; cell invasion

国家自然科学基金资助项目(81502084)

原姗姗,女,1984-03生,硕士,主治医师,E-mail:xasyuanss@126.com.

2017-10-24

R735.2

A

1007-6611(2017)12-1245-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.12.010