唐海灵,郭汉青,张彦亭,闫 媛,庄 坤,张 欣(西安交通大学附属西安市中心医院消化内科,西安 710003;通讯作者,E-mail:zhangxin7798@163.com)

ARHⅠ对胃癌细胞TRAIL凋亡敏感性的影响

唐海灵,郭汉青,张彦亭,闫 媛,庄 坤,张 欣*
(西安交通大学附属西安市中心医院消化内科,西安 710003;*通讯作者,E-mail:zhangxin7798@163.com)

目的 探讨ARHⅠ对TRAIL诱导胃癌细胞BGC-823和MKN-28凋亡敏感性的影响。 方法 以稳定转染pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-ARHⅠ质粒载体的BGC-823胃癌细胞系和稳定转染pU6、pU6-siARHⅠ质粒载体的MKN-28胃癌细胞系为模型,以200 ng/ml的重组人可溶性TRAIL作用于细胞24 h,采用流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测Bax、Bcl-2、活化caspase-3的蛋白表达。 结果 过表达ARHⅠ显著增强了TRAIL诱导的BGC-823胃癌细胞凋亡,凋亡率由(6.85±1.77)%增加至(28.14±3.29)%(P<0.01),而下调ARHⅠ表达显著抑制了TRAIL诱导的MKN-28胃癌细胞凋亡,凋亡率由(35.02±3.89)%降低至(16.27±2.64)%(P<0.01);过表达ARHⅠ能够提高Bax表达2.37±0.18倍(P<0.01)、降低Bcl-2表达0.54±0.06倍(P<0.01),而下调ARHⅠ表达能够降低Bax表达0.45±0.08倍(P<0.01)、提高Bcl-2表达1.92±0.15倍(P<0.01)。 结论 调控ARHⅠ表达能够影响胃癌细胞BGC-823和MKN-28对TRAIL诱导凋亡的敏感性。

胃癌; 抑癌基因; ARHⅠ; TRAIL; 细胞凋亡

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,在所有恶性肿瘤中胃癌发病率居第4位、死亡率居第3位。全球肿瘤统计数据显示,2012年胃癌患者新发病例95.2万,死亡病例70万,其中约50%的患者来自中国(新发病例40.5万,死亡病例32.5万)。近年来,尽管胃癌发病率与死亡率有所下降,但胃癌患者的5年生存率依然较低[1]。

ARHⅠ(aplysia ras homolog Ⅰ)是1999年发现的一种抑癌基因。ARHⅠ属于Ras/Rap超家族,与该家族其他成员的同源性达50%-60%。人类ARHⅠ基因定位于染色体1p31,基因长度为8 kb,包括2个外显子和1个内含子,编码蛋白分子量为26 kDa。ARHⅠ在正常组织和细胞中广泛表达,但在肿瘤组织和细胞中表达降低或缺失,而外源过表达ARHⅠ能够抑制肿瘤细胞的恶性表型[2]。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)属于肿瘤坏死因子超家族,人类TRAIL基因定位于染色体3q26,基因长度为20 kb,共包括5个外显子和4个内含子,编码蛋白为Ⅱ型跨膜蛋白,分子量32.5 kDa。TRAIL也属于抑癌基因,在正常组织中广泛表达,在肿瘤组织中低表达,可通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用[3]。本研究旨在探讨ARHⅠ对TRAIL诱导胃癌细胞凋亡敏感性的影响。

1 材料和方法

1.1 主要仪器

CO2培养箱(Thermo,美国);超净工作台(苏州真田洁净有限公司);荧光显微镜(Olympus,日本);台式低温离心机(Eppendorf,德国);多功能酶标仪(Tecan,瑞士);蛋白电泳仪(Bio-Rad,美国);自动三重纯水蒸馏器(上海精密仪器仪表有限公司);流式细胞仪(Beckman Coulter,美国);凝胶成像分析系统(Alpha Innotech,美国)。

1.2 主要试剂

DMEM高糖细胞培养基(上海联硕生物科技有限公司);胎牛血清(上海玉博生物科技有限公司);重组人可溶性TRAIL蛋白(PeproTech,美国);细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);Bax抗体、Bcl-2抗体、活化caspase-3抗体、β-actin抗体(Cell Signaling,美国);BCA蛋白定量试剂盒(上海玉博生物科技有限公司);ECL化学发光试剂盒(Pierce,美国)。

1.3 细胞培养

西安市中心医院消化内科实验室已建立过表达ARHⅠ和下调ARHⅠ表达的稳定细胞系,即稳定转染pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-ARHⅠ质粒的BGC-823细胞系,稳定转染pU6、pU6-siARHⅠ质粒的MKN-28细胞系[4]。细胞复苏后,用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基于37 ℃、5% CO2条件下常规培养,胰酶消化法传代细胞。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

分别收集上述4种处于对数生长期的BGC-823、MKN-28稳定转染细胞系,接种于6孔板,每孔3×105个细胞,培养24 h,处理组加入200 ng/ml的重组人可溶性TRAIL,继续培养24 h,收集细胞,PBS洗涤细胞2次,加入凋亡染色结合缓冲液,加入Annexin Ⅴ-FITC/PI染料,混匀后室温避光孵育15 min,流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.5 Western blot检测蛋白表达

分别收集上述4种处于对数生长期的BGC-823、MKN-28稳定转染细胞系,接种于25 cm2培养瓶,每瓶1×106个细胞,培养24 h,处理组加入200 ng/ml的重组人可溶性TRAIL,继续培养24 h,收集细胞,PBS洗涤细胞2次,提取总蛋白,采用BCA法进行蛋白定量,制备电泳样品,SDS-PAGE后转膜,封闭后依次加入相应的一抗、二抗,ECL发光法显影并成像。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 过表达ARHⅠ对胃癌细胞TRAIL凋亡敏感性的影响

将稳定过表达ARHⅠ的BGC-823胃癌细胞采用TRAIL处理后,通过流式细胞术检测细胞凋亡状况,结果表明,pIRES2-EGFP组细胞凋亡率为(1.22±0.34)%,pIRES2-EGFP-ARHⅠ组细胞凋亡率为(1.57±0.49)%,而TRAIL处理后,pIRES2-EGFP组凋亡率变为(6.85±1.77)%,pIRES2-EGFP-ARHⅠ组凋亡率变为(28.14±3.29)%(P<0.01,见图1)。因此,过表达ARHⅠ对BGC-823细胞凋亡没有影响,但能够显著增强TRAIL诱导的胃癌细胞凋亡。

与pIRES2-EGFP+TRAIL组比较,**P<0.01图1 过表达ARHⅠ对胃癌细胞TRAIL凋亡敏感性的影响Figure 1 Effects of ARHⅠ overexpression on apoptotic sensitivity of gastric cancer cells to TRAIL

2.2 过表达ARHⅠ和TRAIL对胃癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响

为分析过表达ARHⅠ和TRAIL刺激对BGC-823胃癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响,通过Western blot检测了Bax、Bcl-2、活化caspase-3的表达水平,结果表明,与pIRES2-EGFP组比较,过表达ARHⅠ提高了Bax表达2.37±0.18倍(P<0.01),降低了Bcl-2表达0.54±0.06倍(P<0.01),对活化caspase-3的表达水平无影响(见图2)。TRAIL刺激对Bax、Bcl-2的表达无影响,但提高了活化caspase-3的表达水平,过表达ARHⅠ和TRAIL联合作用进一步显著提高了活化caspase-3的表达水平。

图2 过表达ARHⅠ和TRAIL对Bax、Bcl-2及活化caspase-3表达的影响Figure 2 Effects of ARHⅠ overexpression and TRAIL on Bax, Bcl-2, and activated caspase-3 expression

2.3 下调ARHⅠ表达对胃癌细胞TRAIL凋亡敏感性的影响

将下调ARHⅠ表达的MKN-28胃癌细胞采用TRAIL处理后,通过流式细胞术检测细胞凋亡状况,结果表明,pU6组细胞凋亡率为(12.45±2.18)%,pU6-siARHⅠ组细胞凋亡率为(7.54±1.86)%,而TRAIL处理后,pU6组凋亡率变为(35.02±3.89)%,pU6-siARHⅠ组凋亡率变为(16.27±2.64)%(P<0.01,见图3)。因此,下调ARHⅠ表达能够抑制MKN-28细胞凋亡,并且显著抑制TRAIL诱导的胃癌细胞凋亡。

与pU6+TRAIL组比较,**P<0.01图3 下调ARHⅠ表达对胃癌细胞TRAIL凋亡敏感性的影响Figure 3 Effects of ARHⅠ down-regulation on apoptotic sensitivity of gastric cancer cells to TRAIL

2.4 下调ARHⅠ表达和TRAIL对胃癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响

为分析下调ARHⅠ表达和TRAIL刺激对MKN-28胃癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响,通过Western blot检测了Bax、Bcl-2、活化caspase-3的表达水平,结果表明,与pU6组比较,下调ARHⅠ表达降低了Bax表达0.45±0.08倍(P<0.01),提高了Bcl-2表达1.92±0.15倍(P<0.01，见图4)。

图4 下调ARHⅠ表达和TRAIL对Bax、Bcl-2及活化caspase-3表达的影响Figure 4 Effects of ARHⅠ down-regulation and TRAIL on expression of Bax, Bcl-2, and activated caspase-3

TRAIL刺激对Bax、Bcl-2的表达无影响,但明显提高了活化caspase-3的表达水平,而下调ARHⅠ表达显著抑制了TRAIL诱导的活化caspase-3表达。

3 讨论

ARHⅠ属于Ras/Rap超家族成员,与原癌基因Ras同源性高达54%-59%,但ARHⅠ却属于肿瘤抑制基因,也是Ras/Rap超家族中发现的第一个抑癌基因。体外、体内实验均已证实ARHⅠ能够通过多种机制抑制肿瘤细胞的生长、侵袭和转移[5]。本研究组前期发现,ARHⅠ在胃癌组织和细胞中表达明显降低甚至缺失,与胃癌分化程度及TNM临床分期密切相关,而外源过表达ARHⅠ能够抑制胃癌细胞增殖和迁移,并提高胃癌细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)的化疗敏感性[4,6]。

TRAIL具有显著的肿瘤抑制效果,其对正常细胞没有明显毒副作用,却能够选择性地诱导多种肿瘤细胞发生凋亡,具有十分良好的应用前景,目前重组人TRAIL蛋白已进入Ⅱ期临床实验阶段[7]。TRAIL能够通过结合死亡受体4(death receptor 4,DR4)和死亡受体5(death receptor 5,DR5)而诱导肿瘤细胞凋亡,涉及的凋亡通路包括死亡受体通路和线粒体通路[8]。虽然TRAIL能够选择性地诱导肿瘤细胞凋亡,但有些肿瘤细胞对TRAIL不敏感,即具有一定的耐药性[9]。

本研究结果表明,在BGC-823胃癌细胞中过表达ARHⅠ能够增强其对TRAIL诱导凋亡的敏感性,而在MKN-28胃癌细胞中下调ARHⅠ表达能够降低其对TRAIL诱导凋亡的敏感性,即调控ARHⅠ表达可影响胃癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性,这对于TRAIL应用于胃癌的临床治疗具有一定参考价值,可根据患者的ARHⅠ表达状况预测TRAIL的治疗效果。Bcl-2家族与TRAIL的耐药性密切相关[10]。本研究发现过表达ARHⅠ能够提高促凋亡蛋白Bax的表达、降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,而下调ARHⅠ表达的作用则相反,由此可以推测ARHⅠ影响胃癌细胞TRAIL凋亡敏感性与Bax、Bcl-2的表达变化相关。因此,本研究结果初步证实ARHⅠ与胃癌细胞对TRAIL的凋亡敏感性紧密相关。

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EffectsofaplysiarashomologⅠontheapoptoticsensitivitytotumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligandingastriccancercells

TANG Hailing,GUO Hanqing,ZHANG Yanting,YAN Yuan,ZHUANG Kun,ZHANG Xin*
(DepartmentofGastroenterology,Xi’anCentralHospital,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710003,China;*Correspondingauthor,E-mail:zhangxin7798@163.com)

ObjectiveTo investigate the effects of aplysia ras homolog Ⅰ(ARHⅠ) on the apoptotic sensitivity to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL) in BGC-823 and MKN-28 gastric cancer cells.MethodsBGC-823 gastric cancer cells were stably transfected with plasmid vector pIRES2-EGFP or pIRES2-EGFP-ARHⅠ, and MKN-28 gastric cancer cells were stably transfected with plasmid vector pU6 or pU6-siARHⅠ. These stable cell lines were stimulated by 200 ng/ml recombinant human soluble TRAIL for 24 h. Flow cytometry was used to detect cell apoptosis and Western blot was used to detect the expression of Bax, Bcl-2 and activated caspase-3 protein.ResultsARHⅠ overexpression significantly enhanced TRAIL-induced BGC-823 gastric cancer cell apoptosis, and the apoptotic rate increased from (6.85±1.77)% to (28.14±3.29)%(P<0.01). ARHⅠ down-regulation significantly inhibited TRAIL-induced MKN-28 gastric cancer cell apoptosis, and the apoptotic rate decreased from (35.02±3.89)% to (16.27±2.64)%(P<0.01). ARHⅠ overexpression increased Bax expression by 2.37±0.18 times(P<0.01) and decreased Bcl-2 expression by 0.54±0.06 times(P<0.01), while ARHⅠ down-regulation decreased Bax expression by 0.45±0.08 times(P<0.01) and increased Bcl-2 expression by 1.92±0.15 times(P<0.01).ConclusionRegulation of ARHⅠ expression can affect the apoptotic sensitivity of BGC-823 and MKN-28 gastric cancer cells to TRAIL.

gastric cancer; tumor suppressor gene; aplysia ras homolog I; tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL); cell apoptosis

国家自然科学基金资助项目(81502084)

唐海灵,男,1980-07生,硕士,主治医师,E-mail:xasthl@163.com

2017-10-22

R735.2

A

1007-6611(2017)12-1241-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.12.009